金訶含片抗PM 2.5作用研究

張義智 邵成雷 王振 姬濤 侯曉群

[摘要]斑馬魚注射給予納米活性炭，建立斑馬魚納米活性炭分泌進(jìn)入腸道功能評(píng)價(jià)模型。結(jié)果顯示：金訶含片濃度為56、167和500ug/mL時(shí)，納米活性炭分泌發(fā)生率分別為10.0%、20.0%和23.3%，與模型對(duì)照組（10.0%）比較P均>0.05，提示金訶含片在56、167和500ug/mL濃度時(shí)對(duì)斑馬魚分泌納米活性炭進(jìn)入腸道有促進(jìn)趨勢(shì)，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。

[中圖分類號(hào)]R285.5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2019）22-0007-02

1金訶含片和金嗓子喉片的最大耐受濃度（MTC）測(cè)定

觀察測(cè)定金訶含片和金嗓子喉片對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度（MTC），以確定后續(xù)的功能性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)采用給藥濃度。

1.1受試動(dòng)物 黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司培育，共390尾。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（浙）2012-0171。

1.2受試藥物 金訶含片，棕色粉末，于2017年09月11日收樣，由金河藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供，常溫陰涼避光保存。臨用前用超純水配制成濃度為50mg/mL的母液，-20℃保存。臨用時(shí)用養(yǎng)魚水按需稀釋。

1.3儀器與試劑 解剖顯微鏡（型號(hào)SZX7，OLYMPUS，日本）;精密電子天平（型號(hào)CP214，奧豪斯）;六孔板（型號(hào)Fisher Scientific，中國(guó)）。

1.4濃度組別 實(shí)驗(yàn)1組正常對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組金訶含片125ug/mL，實(shí)驗(yàn)3組金訶含片250ug/mL，實(shí)驗(yàn)4組金訶含片500ug/mL，實(shí)驗(yàn)5組金訶含片1000ug/mL，實(shí)驗(yàn)6組金訶含片1500ug/mL，實(shí)驗(yàn)7組金訶含片2000ug/mL。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 選取受精后2天黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚390尾，分成正常對(duì)照組，藥物組（金訶含片組，金嗓子喉片組）。藥物組分別水溶給予金訶含片和金嗓子喉片125、250、500、1000、1500和2000ug/mL濃度，正常對(duì)照組采用養(yǎng)魚用水正常飼養(yǎng)斑馬魚，每孔斑馬魚30尾，每孔3mL，確保每天更換藥液，處理5天，處理結(jié)束后，觀察記錄斑馬魚的死亡情況，統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚死亡數(shù)量以及毒性情況，確定藥物組最大耐受濃度。

1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果金訶含片在125、250和500ug/mL濃度下，斑馬魚均未出現(xiàn)死亡，也未見任何異常表型;在1000、1500和2000ug/mL濃度下，斑馬魚均出現(xiàn)死亡，死亡率分別為6.7%、16.7%和66.7%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定金訶含片對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）為500ug/mL。

金嗓子喉片在125至2000ug/mL濃度下，斑馬魚均未出現(xiàn)死亡，也未見任何異常表型。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的SOP規(guī)定（供試品的檢測(cè)濃度范圍，上限為2000ug/mL或最大溶解度）和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定金嗓子喉片對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）大于2000ug/mL。

1.7實(shí)驗(yàn)結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下，山東金訶藥物研究開發(fā)有限公司于2017年09月11日提供的金訶含片對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度為500ug/mL，金嗓子喉片對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度大于2000ug/mL。

2 金訶含片對(duì)PM2.5分泌促進(jìn)作用的評(píng)價(jià)

2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察評(píng)價(jià)金訶含片對(duì)斑馬魚體內(nèi)PM2.5分泌的促進(jìn)作用，為金訶含片在抗PM2.5領(lǐng)域開發(fā)提供參考。

2.2受試動(dòng)物黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司培育，共240尾。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（浙）2012-0171。用于金訶含片對(duì)PM2.5分泌的促進(jìn)作用實(shí)驗(yàn)。

2.3受試藥物金訶含片，棕色粉末，于2017年09月11日收樣，由山東金訶藥物研究開發(fā)有限公司提供，常溫陰涼避光保存。臨用前用超純水配制成濃度為50mg/mL的母液，-20℃保存。臨用時(shí)用養(yǎng)魚水按需稀釋。

2.4儀器與試劑甲基纖維素（型號(hào)Sigma，中國(guó)）;解剖顯微鏡（型號(hào)SZX7，OLYMPUS，日本）;精密電子天平（型號(hào)CP214，奧豪斯）;六孔板（型號(hào)Fisher Scientific，中國(guó)）;顯微注射儀（型號(hào)IM-300，Narishige）;拉針儀（型號(hào)PC-10，Narishige，日本）。

2.5濃度組別實(shí)驗(yàn)1組正常對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組模型對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)3組金訶含片56gg/mL，實(shí)驗(yàn)4組金訶含片167ug/mL，實(shí)驗(yàn)5組金訶含片500ug/mL，實(shí)驗(yàn)6組金嗓子喉片222ug/mL，實(shí)驗(yàn)7組金嗓子喉片667ug/mL，實(shí)驗(yàn)8組金嗓子喉片2000ug/mL。

2.6濃度確定依據(jù) 根據(jù)金訶含片（對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）為500ug/mL）和金嗓子喉片（對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）大于2000ug/mu對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度：金訶含片對(duì)PM2.5分泌的促進(jìn)作用評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)為56ug/mL（1/9MTC）、167ug/mL（1/3MTC）和500ug/mL（MTC）;金嗓子喉片對(duì)PM2.5分泌的促進(jìn)作用評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)為222ug/mL（1/9MTC）、667ug/mL（1/3MTC）和2000ug/mL（MTC）。

2.7模型制作以納米活性炭作為PM2.5來源，將納米活性炭（濃度2.3mg/mL）注射到斑馬魚卵黃囊中劑量：69ng/尾，造模。

2.8實(shí)驗(yàn)方法選取斑馬魚240尾，分成正常對(duì)照組，藥物組（金訶含片組，金嗓子喉片組）。將納米活性炭注射到斑馬魚卵黃囊中建立斑馬魚納米活性炭分泌進(jìn)入腸道功能評(píng)價(jià)模型。模型斑馬魚分別水溶給予金訶含片56、167、500ug/mL濃度和金嗓子喉片222、667、2000ug/mL濃度，每孔斑馬魚30尾，每孔3mL，確保每天更換藥液。金訶含片和金嗓子喉片處理5天結(jié)束后，分別統(tǒng)計(jì)斑馬魚發(fā)生體內(nèi)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道的總數(shù)量（Z），通過與模型對(duì)照組比較（卡方檢驗(yàn)），評(píng)價(jià)金訶含片對(duì)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道功能的影響。納米活性炭分泌發(fā)生率計(jì)算公式如下。

進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析和Dunnett's±-檢驗(yàn)的方法，以P<0.05作為具有顯著性差異評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.9實(shí)驗(yàn)結(jié)果金訶含片濃度為56、167和500ug/mL時(shí)，納米活性炭分泌發(fā)生率分別為10.0%、20.0%和23.3%，與模型對(duì)照組（10.0%）比較P均>0.05，提示金訶含片在56、167和500ug/mL濃度時(shí)對(duì)斑馬魚分泌納米活性炭進(jìn)入腸道有促進(jìn)趨勢(shì)，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。

2.10實(shí)驗(yàn)結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下，金訶含片和金嗓子喉片有促進(jìn)斑馬魚分泌納米活性炭進(jìn)入腸道的趨勢(shì)。

4討論

斑馬魚（Danio rerio）是一種簡(jiǎn)單的生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有和哺乳動(dòng)物相似的生物結(jié)構(gòu)和生理功能。幾乎透明的胚胎、胚胎的體外發(fā)育以及與人類高達(dá)87%的基因相似性，使得斑馬魚被廣泛用于藥學(xué)領(lǐng)域的研究。模式動(dòng)物斑馬魚在生態(tài)毒理學(xué)、發(fā)育遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。近年來，斑馬魚模型已拓展延伸至人類疾病動(dòng)物模型、藥物體內(nèi)代謝及創(chuàng)新藥物篩選研發(fā)等諸多方面。國(guó)內(nèi)最新外文獻(xiàn)表明，斑馬魚模型在推動(dòng)疾病動(dòng)物模型、藥物活性篩選及代謝研究方向的研究取得了很大進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)首次將斑馬魚模型用于評(píng)價(jià)抗霧霾作用，為其拓展應(yīng)用提供參考。