實驗大小鼠病原微生物檢測技術及檢測常見問題

章蓉 舒加樂

摘要：該文通過概括實驗大小鼠病原微生物的檢測技術及在檢測工作中遇到的常見問題分析，對病原微生物質量控制的必要性進行闡明，為檢測實驗方法的建立提供參考幫助。

關鍵詞：實驗大小鼠;病原微生物;檢測

中圖分類號：R33 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.19.032

0 引言

隨著我國實驗動物科學的不斷發(fā)展，實驗動物質量有了質的提升，對使用的實驗大小鼠的質量也有更高的要求。實驗大小鼠質量污染可以分為2類：微生物污染、基因污染。微生物污染包括細菌病毒、寄生蟲，基因污染包括基因漂移缺失。為保障動物使用者的生物安全和實驗大小鼠的動物福利，對實驗大小鼠病原微生物污染的檢測顯得更為重要

檢測實驗大小鼠的病原微生物種類是質量檢測的主要目的[1]，其中的病原微生物主要指國標GB14922.2-2011中規(guī)定的細菌、病毒、寄生蟲等等?？焖佟⒏咝?、準確的實驗動物病原微生物檢測方法可以提高試驗結果的可信度。如果國標中規(guī)定的不允許出現的微生物被檢出，輕的會引起實驗大小鼠患病、影響試驗的數據和結果拖延科研進程，重的可能會引起人畜共患病的傳播流行，造成公共安全事故[2]。實驗大小鼠微生物的檢測必須得到重視，它是科研服務、公共衛(wèi)生安全的基礎保障。

目前最常用的檢測方法有培養(yǎng)基檢測法及酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法等。其中使用的設備均是常規(guī)科研設備[3]。實驗大小鼠病原微生物檢測對專業(yè)水平要求很高，檢測人員必須熟練掌握微生物學相關知識和實驗操作技能。同時，病原菌檢測的實驗室環(huán)境必須受到嚴格控制，必須達到生物安全實驗室標準。實驗大小鼠病原微生物的檢測工作較為復雜，樣品污染可能出現在取樣、運輸、檢測等各個環(huán)節(jié)。保證檢測結果的準確也是工作的重點。

1 檢測技術

1.1 培養(yǎng)鑒定技術

分離培養(yǎng)是實驗大小鼠國標中檢測細菌的標準方法，也是目前最常使用的一種細菌定性檢測技術。不同類型、不同種類的微生物對培養(yǎng)基的要求不一樣，因此在對樣本進行細菌分離培養(yǎng)中，需要嚴格區(qū)分培養(yǎng)基的種類與范圍。分離培養(yǎng)是利用在特定培養(yǎng)基中加入指示劑和反應底物，使目標病原菌產生特定的顏色形態(tài)或熒光等，將目標病原菌與其他雜菌相區(qū)分。之后將目標病原菌分離純化，再用生化原理，對病原菌生長代謝中產生的特異性酶類進行鑒定。該檢測方法具有直觀性，對實驗條件要求不高。但缺點是耗時長、操作復雜、需要操作人員有豐富經驗。

1.2 免疫學技術

免疫學檢測方法是國標中對培養(yǎng)條件苛刻的病原菌及病毒檢測的標準方法，該方法是根據抗原抗體特異性反應對病原菌進行鑒定。包括酶聯免疫吸附法、免疫磁珠分離法、雙功能抗體檢測技術、膠體金技術等。其中的酶聯免疫吸附檢測法（ELISA）是目前發(fā)展較為成熟的免疫學檢測方法，是利用實驗大小鼠血清中病原微生物產生的抗體與檢測板中預包被的特異性抗原的結合，再輔以顯色劑，使感染某種病原微生物并產生抗體的實驗大小鼠血清可通過分光光度計的讀數，進行判定的一種檢測方法。該方法可用于檢測國標中清潔級實驗大小鼠必須排除的泰澤菌、支原體及病毒等。酶聯免疫吸附法的優(yōu)點是耗時短，操作簡單，中間步驟少，避免了交叉污染等不確定因素對實驗結果的影響。但其成本較高，且存在由于抗原特異性低而造成的假陽性結果。

1.3 分子生物學技術

PCR技術是一種聚合酶鏈式反應，可使極其微量的某一特定序列的DNA片段在應用特異性的引物擴增到百萬倍以上，能準確地檢測一些人工無法培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的微生物，提高對實驗大小鼠微生物感染的診斷檢查內容和診斷能力。隨著分子生物學檢測技術的發(fā)展，PCR技術已在病原微生物的檢測中廣被泛應用[4]。而以PCR為基礎的基因芯片技術也逐漸應用在其中。另外，PCR技術還可以通過使用通用引物，對其產物的序列進行分析，同數據庫中已有微生物序列進行比對，進而準確鑒定病原微生物的種類，極大節(jié)約人力物力財力。PCR技術具有程序快捷、操作簡單、檢測靈敏及高特異性特點但其對引物特異性要求較高，需要特殊的實驗儀器，對實驗環(huán)境要求嚴格，一旦出現分子層面的體系污染，則很難徹底清除。

1.4 體內外寄生蟲檢測技術

體表寄生蟲可以通過對實驗大小鼠進行輕度麻醉后，根據寄生蟲生活習性及寄居部位，直接在顯微鏡下鏡檢。體內寄生蟲則需要將送檢動物安樂死后，取盲腸內容物進行涂片和懸浮后，顯微鏡下進行鏡檢。直觀快速的顯微鏡下直接鏡檢只針對成蟲，而蟲卵是實驗大小鼠污染寄生蟲的最大隱患，蟲卵對惡劣環(huán)境及消毒劑的抵抗力也強于成蟲，成蟲一旦產卵，蟲卵數量驚人，且很難徹底清除，因此，對寄生蟲蟲卵的檢測顯得更為重要，針對實驗大小鼠體外寄生蟲蟲卵，可以麻醉后直接鏡檢，如螨蟲蟲卵通常會在實驗大小鼠毛根處粘附的米白色、橢圓形蟲卵，且很難從毛根處取下。實驗大小鼠體內寄生蟲蟲卵，需排出體外后才能進行傳播，因此可根據成蟲產卵習性，進行檢測，如蠕蟲成蟲通常會在實驗大小鼠肛周進行產卵，使用透明膠帶粘取肛周皮膚，再將透明膠帶粘于載玻片上鏡檢，即可直接觀察到成紡錘狀蟲卵。直接在實驗大小鼠腸道內產卵的寄生蟲，則需要在動物糞便中進行蟲卵的檢測，離心法、飽和鹽水漂浮法等是常用檢測寄生蟲蟲卵的方法。另外，PCR技術也可應用于寄生蟲蟲卵的檢測。

2 常見問題

實驗大小鼠病原微生物檢測是一項較為復雜的工作，涉及采樣程序、樣品處理和留存、特定微生物檢測程序和方法、人員操作和經驗等，其中任何一個環(huán)節(jié)出現問題，都會對檢測結果造成很大影響。

2.1 樣品采集

采樣不及時，常見于動物血液采集，在動物處于麻醉狀態(tài)或剛剛死亡后需要及時采集新鮮血液樣本，如動物死亡時間較長，血液已凝固，則無法采集到合格的新鮮血液用于血清提取。樣本采集過程中，由于采樣器械或操作環(huán)境問題，樣本污染或多個樣本之間交叉污染。樣本采集時，未預留樣本備份，在出現疑似陽性的情況下用于復檢。很多工作者的檢測意識不規(guī)范，在檢測中忽略陽性和陰性對照組的設置，在檢出陽性結果的同時不能判定是動物本身的衛(wèi)生物污染還是在操作中使用的污染耗材，這就影響了最終結果的判定。由于引起實驗大小鼠污染的微生物種類越來越多，許多國外引入的實驗大小鼠也會帶有致病性的微生物，這也需要檢測人員具有更新更全面的專業(yè)知識。

2.2 應對方案

首先，檢測實驗室的工作人員必須有嚴格的無菌觀念。這樣既可防止試驗操作中樣品的人為污染，又可保障工作人員的生物安全。其次，檢測人員需要不定期接受專業(yè)技能培訓，用SOP規(guī)范檢測人員的專業(yè)操作，提高責任意識。最后，做好完整的檢測記錄，及時整理歸檔，保證所有數據的可追溯性。這樣可以準確跟蹤到陽性污染大小鼠，及時處理，避免微生物污染的傳播和擴大。

3 結束語

做好病原微生物的檢測工作是實驗大小鼠質量控制的重要手段，需要從不同的方向進行改進和努力，包括購買先進檢測設備、完善檢測規(guī)章制度、提高檢測技能水平等。為得到高質量的檢測結果，需要對每一個環(huán)節(jié)進行嚴格把控，這樣才能更好為國家的科研事業(yè)保駕護航。

參考文獻

[1]向志光，佟巍，張麗芳，等.實驗動物國家標準中大小鼠微生物檢測項目的考量[J].中國比較醫(yī)學雜志，2016，26（2）：33-39.

[2]鄒小娟.實驗室實驗動物人畜共患病的防控探討[J].當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2017（2）：45.

[3]費楓.畜牧獸醫(yī)實驗室人畜共患病的防控措施研究[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2017，38（11）：13-16.

[4]張越華，鄭秀青.PCR技術在SPF級實驗動物鼠檢測中的應用[J].當代畜牧，2017（1）：46-48.

作者簡介：章蓉（1979-），女，湖北人，高級實驗師，碩士。