煙草PP2C家族基因降雨量響應(yīng)表達(dá)模式分析

何曉健 張柳 王戈 程亞東 毛自朝 楊煥文

摘? 要：PP2C是一類單體絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，廣泛參與生物體內(nèi)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PP2C基因家族的鑒定和功能研究已在多種作物上報(bào)道。為探明不同降雨量條件下煙草PP2C基因家族表達(dá)特征，通過塑料大棚內(nèi)模擬人工定量噴灌試驗(yàn)和不同降雨量的田間試驗(yàn)，利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)移栽后40和60 d煙葉中PP2C家族基因進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果顯示，18個(gè)煙草PP2C家族基因的表達(dá)明顯受降雨量影響，可分成9個(gè)亞族。其中6個(gè)PP2C家族成員的表達(dá)隨著降雨量增大而降低，4個(gè)PP2C家族成員的表達(dá)隨著降雨量增大而升高。本研究初步探明了云煙87中受降雨量影響的PP2C基因家族種類及其表達(dá)特點(diǎn)，為抗旱育種和抗旱栽培提供參考。

關(guān)鍵詞：煙草;降雨量;PP2C;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S572.01????????? 文章編號(hào)：1007-5119（2019）02-0044-08????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.02.007

Abstract： PP2C is a class of monomeric serine/threonine protein phosphatases that are widely involved in multiple signal transduction pathways in organisms. Identification and functional studies of the PP2C gene family have been reported in a variety of crops. In order to ascertain the expression characteristics of tobacco PP2C gene family members under different rainfall conditions， the expression of PP2C family genes in tobacco leaves at 40 and 60 days after transplanting was analyzed by RNA-Seq technique through simulated artificial quantitative irrigation in plastic greenhouse and field experiments with different rainfall. The results showed that the expression of 18 tobacco PP2C family genes was significantly affected by rainfall and could be divided into 9 subfamilies. The expression of six PP2C family members decreased with increasing rainfall， and the expression of four PP2C family members increased with increasing rainfall. In this study we have preliminarily identified the types and expression characteristics of the PP2C gene family affected by rainfall in Yunyan 87， providing reference for drought-resistant breeding and drought-resistant cultivation.

生物體內(nèi)普遍存在由蛋白激酶和蛋白磷酸酶介導(dǎo)的可逆磷酸化反應(yīng)，在調(diào)控植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[1]。針對(duì)不同特異性底物和特定抑制劑敏感性不同，蛋白磷酸酶（PPs）通常被分為PP1，PP2A，PP2B或PP2C[2]。PP2Cs是一類依賴Mg2+或Mn2+的單體絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶[3-4]，也是高等植物中最大的蛋白磷酸酶家族[5]，在真核生物脫落酸、茉莉酸、水楊酸等信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)控作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中有80個(gè)PP2C基因[8]，水稻中有78個(gè)[9]，其中擬南芥PP2C基因被分為A-E、F1、F2、G-L共13個(gè)亞族[8]。相關(guān)研究顯示，PP2C酶催化可逆磷酸化作用，并反作用特定蛋白激酶，調(diào)控ABA信號(hào)通路，與水分等非生物逆境脅迫的耐受性相關(guān)，進(jìn)而影響植物生長發(fā)育[10]。

水分是影響煙草生長的重要因子，除了灌溉外，降雨是煙草生長水分供應(yīng)的關(guān)鍵途徑[11]。我國許多煙區(qū)年降雨量分布不均，影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[12]。作為重要的生態(tài)因子，降雨量影響著煙草基因的表達(dá)[11]。目前對(duì)煙草中PP2C家族基因雖有一些報(bào)道[13]，但不同降雨量條件下煙草PP2C家族基因的表達(dá)尚未見相關(guān)研究，本研究利用已公開的NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)（PRJNA319578、PRJNA208209）結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室建立的云煙87煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（PRJNA206414）進(jìn)行PP2C家族基因的預(yù)測(cè)，對(duì)塑料大棚內(nèi)降雨量模擬試驗(yàn)和不同降雨量田間試驗(yàn)下的云煙87葉片樣品進(jìn)行RNA-Seq，結(jié)合生物信息學(xué)分析，探究了降雨量對(duì)煙草PP2C家族基因表達(dá)的影響，為煙草的抗旱育種與栽培提供指導(dǎo)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)分為塑料大棚內(nèi)模擬試驗(yàn)和大田驗(yàn)證試驗(yàn)兩部分。供試烤煙品種為云煙87。

模擬試驗(yàn)在云南玉溪趙桅烤煙試驗(yàn)點(diǎn)（102.29° E，24.18° N，海拔1645 m）進(jìn)行，搭建簡易塑料大棚進(jìn)行避雨栽培，大棚四周通風(fēng)良好，棚內(nèi)溫度條件與室外試驗(yàn)基本一致。參照降雨量有顯著差異的云南3個(gè)地區(qū)34年的年均降雨量及其旬分布特征，設(shè)計(jì)低、中、高3個(gè)降雨量處理：低降雨量（≤500 mm，典型區(qū)域?yàn)闁|川）、中等降雨量（650～700 mm，典型區(qū)域?yàn)榻ǎ┖透呓涤炅浚ā?100 mm，典型區(qū)域?yàn)閷幎M(jìn)行降雨量模擬人工定量噴灌。3個(gè)處理移栽后0～40 d的模擬旬降雨量分別為32、42和71 mm（與東川、江川、寧洱3地34年平均降雨量等同），移栽后40～60 d模擬旬降雨量分別為30、53和90 mm，每5天模擬降雨1次。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)小區(qū)（重復(fù)），每個(gè)小區(qū)按照株行距50 cm×120 cm栽種36株烤煙，小區(qū)規(guī)格為6 m×3.6 m，小區(qū)四周各設(shè)2列保護(hù)行。其他栽培管理措施與常規(guī)大田試驗(yàn)相同。

為了驗(yàn)證塑料大棚內(nèi)降雨量模擬試驗(yàn)中PP2C家族基因表達(dá)變化情況，在文山硯山（104.38° E，23.59° N，海拔1540 m）、普洱寧洱（101.08° E，23.06° N，海拔1340 m）和玉溪江川（102.75° E，24.32° N，海拔1725 m）3個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行大田驗(yàn)證。煙苗移栽成活后不澆水，統(tǒng)計(jì)當(dāng)?shù)貙?shí)際降雨量。硯山、寧洱、江川移栽后0～40 d實(shí)際旬均降雨量分別為13 mm、11.5 mm、124 mm，移栽后40～60 d實(shí)際旬均降雨量分別為18 mm、19 mm、227 mm。塑料大棚內(nèi)模擬試驗(yàn)及大田驗(yàn)證試驗(yàn)的旬降雨量統(tǒng)計(jì)見圖1。

1.2? RNA-Seq技術(shù)

塑料大棚內(nèi)模擬試驗(yàn)和大田驗(yàn)證試驗(yàn)分別在移栽40和60 d后取樣，每個(gè)小區(qū)取3株煙，選取從下向上第10葉（中部煙葉），3個(gè)葉片混合作為一個(gè)樣品，每個(gè)處理共3次生物學(xué)重復(fù)。用不銹鋼剪刀剪去葉尖、葉基和主脈，取葉片中部，用鋁箔紙包裹好后用液氮速凍，分裝50 mL離心管中，?80 ℃儲(chǔ)存，用于RNA-Seq測(cè)序分析。

使用改良的CTAB法提取樣品總RNA。取質(zhì)量合格的總RNA 6 μg，利用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，對(duì)cDNA片段進(jìn)行末端修復(fù)和銜接子連接后，將產(chǎn)物純化并用PCR富集以產(chǎn)生最終的cDNA文庫。文庫質(zhì)控合格后使用Illumina HiSeq?2000進(jìn)行測(cè)序。將獲得的原始讀段（reads）經(jīng)過去接頭和低質(zhì)量堿基的清洗獲得clean reads，并對(duì)參考數(shù)據(jù)通過Tophat進(jìn)行短序列比對(duì)獲得SAM數(shù)據(jù)文件。SAM交由cufflinks軟件包做差異分析獲得基因的表達(dá)量（RPKM值）。對(duì)表達(dá)量相差兩倍以上，P<0.05的PP2C家族基因進(jìn)行差異分析[14]。

1.3? 煙草PP2C候選基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

利用已公開的NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)（PRJNA319578、PRJNA208209）結(jié)合實(shí)驗(yàn)室建立的云煙87煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（PRJNA206414）進(jìn)行PP2C家族基因的預(yù)測(cè)，獲得56個(gè)云煙87的PP2C家族基因。挑選2個(gè)以上處理RPKM值大于1的基因作為對(duì)降雨量有明顯響應(yīng)的PP2C家族基因，最終獲得18個(gè)候選PP2C家族基因。進(jìn)行NCBI和中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫Blast比對(duì)、ORF分析（NCBI ORFfinder，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/）、結(jié)構(gòu)域分析（Pfam database，http：//pfam.xfam.org/）、蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)（ExPASy，http：//web.expasy.org/protparam/）、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)（WoLF PSORT，http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）和Clustalx氨基酸多序列比對(duì)以及MEGA5.0系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析。

1.4? 不同降雨量下表達(dá)模式分析

2? 結(jié)? 果

2.1? 表達(dá)受降雨量影響的煙草PP2C家族基因鑒定

利用RNA-Seq測(cè)序獲得18個(gè)隨降雨量變化有明顯響應(yīng)并具有完整ORF的候選PP2C基因家族成員。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫和中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)分別命名為NtPP2C01、NtPP2C10、NtPP2C12、NtPP2C27、NtPP2C28、NtPP2C33、NtPP2C34、NtPP2C35、NtPP2C37、NtPP2C43、NtPP2C49、NtPP2C50、NtPP2C52、NtPP2C58、NtPP2C59、NtPP2C60、NtPP2C63、NtPP2C76。通過分析NtPP2C家族基因理化性質(zhì)，結(jié)果顯示18個(gè)NtPP2C基因家族成員中，蛋白質(zhì)編碼最長的526 aa，最短的267 aa，等電位范圍從4.49～9.19，18個(gè)煙草PP2C家族基因均含有PP2C保守結(jié)構(gòu)域（表1）。

2.2? 表達(dá)受降雨量影響的煙草PP2C家族基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用WoLF PSORT對(duì)18個(gè)煙草PP2C家族基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明表達(dá)受降雨量影響的煙草PP2C家族基因在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中表達(dá)集中，在過氧化物酶體、細(xì)胞骨架、液泡、高爾基體和細(xì)胞基質(zhì)中少量表達(dá)，在細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不表達(dá)（表2）。表達(dá)受降雨量影響的煙草PP2C家族基因表達(dá)部位的不同可能與其執(zhí)行不同的功能有關(guān)。

2.3? 表達(dá)受降雨量影響的煙草PP2C基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

個(gè)與煙草候選PP2C基因蛋白同源性相近的水稻PP2C基因編碼蛋白，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），根據(jù)擬南芥和水稻PP2C基因的分類，18個(gè)云煙87煙草的PP2C基因分別屬于A、D、E、F1、F2、G、H、K、L 9個(gè)亞族。其中NtPP2C37和NtPP2C50屬于A亞族，NtPP2C43、NtPP2C60和NtPP2C63屬于D亞族，NtPP2C33、NtPP2C34和NtPP2C52屬于E亞族，NtPP2C10、NtPP2C28和NtPP2C58屬于F1亞族，NtPP2C59和NtPP2C76屬于F2亞族，NtPP2C27和NtPP2C49屬于G亞族， NtPP2C12屬于H亞族，NtPP2C01屬于K亞族， NtPP2C35屬于L亞族。

2.4? 表達(dá)受降雨量影響的煙草PP2C基因表達(dá)趨勢(shì)

按照降雨量從低到高排列，通過塑料大棚內(nèi)數(shù)據(jù)（圖3）和大田驗(yàn)證數(shù)據(jù)（圖4）比較后發(fā)現(xiàn)，

塑料大棚內(nèi)試驗(yàn)云煙87的PP2C家族基因在移栽后40 d沒有移栽后60 d的變化顯著?？赡苁且圃院?0 d烤煙正處于團(tuán)棵期后期，而移栽后60 d烤煙正處于旺長期，烤煙旺長期對(duì)水分和降雨量更為敏感，因此PP2C家族基因的表達(dá)差異大。并且在塑料大棚內(nèi)精準(zhǔn)調(diào)控條件下，基因家族表達(dá)的規(guī)律性更強(qiáng)，所以在隨后PP2C家族基因表達(dá)變化的分析中，主要以60 d獲得的數(shù)據(jù)為主。采用基因表達(dá)隨降雨量的高低變化進(jìn)行趨勢(shì)分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，塑料大棚內(nèi)和大田驗(yàn)證試驗(yàn)中NtPP2C37、NtPP2C63、NtPP2C34、NtPP2C10、NtPP2C58、NtPP2C49? 6個(gè)基因總體表達(dá)隨著降雨量的增大而降低。NtPP2C50、NtPP2C43、NtPP2C33、NtPP2C52? 4個(gè)基因總體表達(dá)隨著降雨量的增大而升高。

3? 討? 論

利用RNA-Seq可以很方便地對(duì)植物基因表達(dá)情況進(jìn)行分析[15]。本研究分別在塑料大棚內(nèi)模擬和大田不同降雨量下開展煙草栽培試驗(yàn)，并采集栽后40 d和栽后60 d不同處理的樣品，通過RNA-Seq，共鑒定了18個(gè)對(duì)降雨量有明顯響應(yīng)的煙草PP2C家族基因?；蚨ㄎ活A(yù)測(cè)表明，這18個(gè)煙草PP2C家族基因主要在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和細(xì)胞核中表達(dá)。根據(jù)煙草、擬南芥和水稻PP2C基因編碼蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果，將18個(gè)煙草PP2C家族基因分成9個(gè)亞族：A、D、E、F1、F2、G、H、K、L亞族。

PP2C是一類具有多種功能的蛋白磷酸酶，在植物水分脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用[16-17]。相關(guān)研究顯示，A亞族調(diào)控脫落酸（abscisic acid，ABA）信號(hào)途徑[18]，擬南芥ABI1和ABI2基因?qū)儆贏亞族[19]，是ABA信號(hào)途徑中的調(diào)控基因[20-21]。B亞族在蛋白激酶MAPK途徑起作用[22]，苜蓿中B亞族是MAPK途徑中的負(fù)調(diào)控因子，受逆境脅迫誘導(dǎo)[23-24]。C亞族與花器官發(fā)育相關(guān)[4]。G亞族擬南芥基因AtPP2CG1能夠調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)[25]。E亞族在丹參中預(yù)測(cè)與植物組織器官發(fā)育相關(guān)[26]。

基因調(diào)控是復(fù)雜而多元化的過程，塑料大棚內(nèi)環(huán)境較單一，誘導(dǎo)基因家族表達(dá)的條件可控，通過綜合分析塑料大棚內(nèi)和大田試驗(yàn)不同降雨量下PP2C基因家族表達(dá)量變化，NtPP2C37、NtPP2C63、NtPP2C34、NtPP2C10、NtPP2C58、NtPP2C49六個(gè)基因總體表達(dá)隨著降雨量的增大而降低，可能與干旱脅迫等非逆境脅迫相關(guān)。趙娜[27]研究發(fā)現(xiàn)中間錦雞兒CiPP2C37-like在干旱、高鹽、低溫和ABA脅迫下表達(dá)量上調(diào)。閔東紅等[1]發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫處理下，谷子SiPP2C10相對(duì)表達(dá)量上調(diào)2倍以上。這與本文研究結(jié)果相一致，推測(cè)NtPP2C37和NtPP2C10為抗旱相關(guān)基因。NtPP2C50、NtPP2C43、NtPP2C33、NtPP2C52四個(gè)基因總體表達(dá)隨著降雨量的增大而升高，可能與煙草水分代謝相關(guān)。同家族中不同基因差異表達(dá)結(jié)果不盡相同，可能是存在不同的應(yīng)答機(jī)制。

水分是影響煙草生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，煙草產(chǎn)量和質(zhì)量的形成很大程度上決定于其生育期水分供應(yīng)。隨著降雨量增多，煙草中發(fā)生了豐富的基因調(diào)控變化[11]，通過研究低、中、高降雨量下PP2C家族基因的表達(dá)變化，可以有針對(duì)性地篩選與抗旱性有關(guān)的PP2C家族基因，為后續(xù)抗旱育種和抗旱栽培奠定基礎(chǔ)。

4? 結(jié)? 論

本研究利用NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室建立的云煙87煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了云煙87中18個(gè)對(duì)不同降雨量有明顯響應(yīng)的PP2C家族基因，可分成9個(gè)亞家族。其中6個(gè)PP2C家族成員的表達(dá)隨著降雨量的增多而降低，4個(gè)PP2C家族成員的表達(dá)隨著降雨量增多而升高。本研究可為抗旱育種和抗旱栽培提供參考。

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