豬非典型性瘟病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應用

郭佳琪　楊曉宇　馮宇　楊釩　徐志文　朱玲

摘要：為建立一種快速、準確檢測豬非典型性瘟病毒（APV）的方法，根據(jù)Genbank發(fā)布的APPVNS2基因序列，設計合成1對擴增后目的基因片段大小為500bp的特異性引物。建立的R’T-PCR方法對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、偽狂犬病毒（PRV）和豬瘟病毒（CSFV）的檢測結(jié)果均為陰性，該方法對APPV的最低檢岀量為1μl4.95×10拷貝，重復性試驗中組間、組內(nèi)試驗結(jié)果均與預期相符。應用該方法對68份疑似患病的仔豬樣品進行檢測，陽性病料檢出率為7.35%。利用Mega7.0繪制APⅤ系統(tǒng)進化樹，對APPⅤ進行遺傳進化分析，結(jié)果顯示本試驗檢出的APPⅤ（SC株）與中國報道的APPV的親緣關(guān)系較近。建立的APPV RT-PCR檢測方法可用于APPV的臨床診斷及流行病學檢測。

關(guān)鍵詞：豬非典型性瘟病毒;RT-PCR;檢測

中圖分類號：S858281.34+7

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0357-06

仔豬先天性震顫（Congenital tremors，CT）會導致仔豬出生后數(shù)小時內(nèi)出現(xiàn)骨骼肌雙側(cè)痙攣性收縮，妨礙仔豬站立、步行和尋找乳頭3，致使仔豬饑餓和初乳攝入不足，嚴重的可導致仔豬死亡。一般根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)是否發(fā)生病變，將CT分為A型和B型，A型有明顯的大腦和脊柱的組織學損傷，B型無損傷45。A型又可分為A～A-V5種亞型，其中只有A-I型與AⅡ型具有傳染性。A-型一般認為是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起，以小腦發(fā)育不全為特征67。AⅡ型的病因存在一定爭議，直到2015年，Hause等通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)了豬非典型性瘟病毒（Atypical porcine pestivirus virus，APPV）2016年，Arruda9確定APPV是A的病因。隨后，德國、荷蘭、奧地利等多個國家先后發(fā)現(xiàn)豬群存在APPV流行0。2017年，華南農(nóng)業(yè)大學許古明等1首次發(fā)現(xiàn)中國豬群APPV的發(fā)生，這使中國獸醫(yī)學界展開了對APPV的研究。

APPⅤ屬于黃病毒科瘟病毒屬，該病毒屬還包括牛病毒性腹瀉病毒1型（Bovine viral diarrhea virus1，BVDV-1）和2型（Bovine viral diarrhea virus-2BVDV-2）、豬瘟病毒（CSFV）和邊界病病毒（Borderdisease virus，BDV）及之后發(fā)現(xiàn)的其他瘟病毒（Ho[12]1-llke pestivirus APPV是基因組長約11kb的RNA病毒，包含上游5UTR、ORF和下游3UTR，ORF區(qū)編碼的蛋白質(zhì)可分為4種結(jié)構(gòu)蛋白（C、Ems、E1、E2）和8種非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[14]。

RT-PCR檢測方法對樣品純度要求低，不用分離病毒及培養(yǎng)細胞，具有操作簡單快速、成本低、敏感性高等特點5，建立APPV的RT-PCR檢測方法對于國內(nèi)豬非典型性瘟病毒的檢測研究具有重要意義。我們根據(jù)Gen bank發(fā)表的APPⅤ基因組序列，選擇APPV MS2基因，建立RT-PCR快速檢測方法，通過該方法對采自規(guī)模化豬場的疑似患病樣品進行檢測，并對其陽性樣品PCR產(chǎn)物進行基因測序和遺傳進化分析，為獸醫(yī)臨床診斷提供一種可靠的檢測方法。

1材料與方法

1.1 病毒和病料

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）、偽狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）和豬瘟病毒（CSFV）均由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心保存。病料（頜下淋巴結(jié)、小腦、腹股溝淋巴結(jié)等）采自四川省遂寧、邛崍、大邑、崇州、宜賓等地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)豬場。

1.2 主要試劑

5×Prime script buffer、Prime Script rt enzyme MixI、Oligo dT primer、Random 6 mers，RNase free dH2O、DL2000 DNA marker、Trizol、Taq Hs、10×Reaction buffer（Mg2+free）均購自寶生物工程（大連）有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Kit I）購自Omega公司。

1.3 APPV引物設計與合成

根據(jù)Genbank發(fā)表的APⅤ基因組序列，選擇APPVNS2基因，應用NCB設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物序列為5′GAACTAAGACCAACACGGAT-3′，下游引物序列為5′-GAGGGTAGGAAGGGAAAG-3′，其預期擴增片段大小為500bp，稀釋為20μmo/L備用。

1.4 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

將疑似患非典型性豬瘟的樣品充分剪碎，加入液氮研磨成粉末，再加入適量生理鹽水保存于EP管中備用。采用Til法提取病料RNA，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA。反轉(zhuǎn)錄體系（10.0）：RNase free dH2O 3.51，5×Prime script buffer 2.0ul，Random 6 mers 0.5 ul，Oligo dT primer0.5 ul，Primer Script RT enzyme Mix 10.5 ulRNA模板3.0μ。產(chǎn)物于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 APPV的RT-PCR方法建立

PCR反應體系（25.0μl）為：eDNA2.0μl，10xReactionbuffer2.5μl，dNTPMix1.0μl，TaqHs0.5μl，上、下游引物各0.5μl，加ddH20至25.0μl。反應條件為：95.0C4min;95.0C30s，58.4C30s，72.0C30s，30個循環(huán);72.0C7min。

1.5.1 Mg2+、TaqHs、dNTPMix用量的優(yōu)化PCR反應體系總體積25.0μl保持不變，分別調(diào)整Mg2*、TaqHs、dNTPMix的用量，對反應體系進行優(yōu)化。Mg2+用量依次為0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl和3.0μl，TaqHs用量依次為0.1μl、0.2μl0.3μl、0.4μl、0.5μl和0.6μl，dNTPMix用量依次為1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl和3.5μl。在單一變量的情況下，選取目的條帶擴增效果最好的試劑用量。

1.5.2 引物用量及退火溫度優(yōu)化在Mg2*、TaqHs、dNTPMix用量優(yōu)化的基礎上，分別改變引物用量（1.0 μl、1.5 μl、2.0 μl和2.5 μl）和退火溫度（52.0℃、52.7℃、54.0℃、55.9℃、58.4℃、60.3℃、61.4℃、和62.0℃、），進行PCR擴增，篩選最適引物用量和退火溫度。

1.5.3 RT-PCR的特異性試驗在上述優(yōu)化條件下，應用建立的RT-PCR方法對APPV、PRRSV、PRV、CSFV進行特異性檢測，設陰性對照組，驗證該方法的特異性。

1.5.4 RT-PCR的敏感性試驗用質(zhì)粒提取試劑盒提取APPV質(zhì)粒，用核酸蛋白質(zhì)儀測定所構(gòu)建的陽性質(zhì)粒濃度，計算出模板的拷貝數(shù)。在上述優(yōu)化條件下，將模板進行倍比稀釋進行RT-PCR，以驗證本方法的敏感性。

1.5.5 RT-PCR的重復性試驗提取APPV陽性病料RNA，以反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物為模板，應用建立的RT-PCR方法分別進行組間、組內(nèi)重復性試驗，以驗證本方法的穩(wěn)定性。

1.6 臨床樣品檢測及陽性樣品鑒定

將68份樣品病料充分剪碎，加入液氮研磨成粉末，再加入適量生理鹽水制得研磨液，-20℃、保存?zhèn)溆?。Trizol法提取病料的RNA，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成eDNA，然后用建立的RT-PCR方法進行APPV檢測，對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.7 遺傳進化分析

應用Mega7.0軟件對獲得的陽性序列、GenBank公布的APPV基因序列和同是黃病毒科瘟病毒屬的BVDV-1、BVDV-2、BDV、CSFV等毒株基因序列共同繪制系統(tǒng)進化樹，分析APPV的遺傳與進化規(guī)律，豐富完善APPV流行病學資料。

2 結(jié)果

2.1 豬非典型性瘟病毒NS2基因的RT-PCR擴增

將疑似患病樣品處理后提取其RNA，用設計的引物進行RT-PCR反應。電泳結(jié)果顯示，本研究設計的引物擴增出1條約500 bp的條帶（圖1），與預期結(jié)果一致。

2.2 豬非典型性瘟病毒（APPV）RT-PCR檢測的優(yōu)化反應條件

在其他條件不變的情況下對Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量單一變量進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當Mg*+、Taq Hs、dNTP Mix用量分別為2.5 μl、0.6 μl、1.0 μl時，擴增的條帶最為清晰（圖2、圖3、圖4）。

固定25μlPCR反應體系的其他條件不變，對引物用量和引物退火溫度進行優(yōu)化。結(jié)果表明最佳引物用量為2.5 μl（圖5），最佳退火溫度為58.4℃（圖6）。

2.3 豬非典型性瘟病毒（APPV）RT-PCR檢測的特異性

對建立的APPVRT-PCR檢測方法的特異性進行試驗，結(jié)果表明建立的APPV RT-PCR檢測方法對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、偽狂犬病毒（PRV）和豬瘟病毒（CSFV）的檢測結(jié)果均為陰性（圖7）。說明本研究建立的方法特異性強，與其他病原無交叉反應。

2.4 豬非典型性瘟病毒（APPV）RT-PCR檢測的敏感性

采用建立的RT-PCR檢測方法對倍比稀釋后的APPV陽性質(zhì)粒進行擴增，1%瓊脂糖電泳觀察。用NanoDrop測定6號APPV樣品檢出量為1 μl4.95x10*拷貝（圖8），表明該方法敏感性較強。

2.5 豬非典型性瘟病毒（APPV）RT-PCR檢測的重復性

對樣品中豬非典型性瘟病毒核酸分別進行組間、組內(nèi)重復性試驗，結(jié)果均一致（圖9），表明本試驗方法的重復性較好。

2.6 建立的APPVRT-PCR檢測方法對臨床樣品的檢測應用

利用本試驗建立的RT-PCR檢測方法對68份疑似患病樣品進行檢測，共檢出陽性樣品5份，陽性檢出率為7.35%。將5份陽性樣品的PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果證實目的條帶均為APPV NS2基因的特異性片段。測序分析結(jié)果與RT-PCR結(jié)果高度一致，進一步驗證了本試驗建立的檢測方法的特異性與準確性。

2.7 豬非典型性瘟病毒（APPV）遺傳進化分析

將檢出的臨床陽性樣品RT-PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測序。用Mega7.0軟件對APPV陽性樣品的基因序列和GenBank已發(fā)表的APPV基因序列，以及與APPV同科同屬的BVDV-1、BVDV-2、BDV、CSFV等基因序列進行遺傳進化分析。結(jié)果（圖10）表明，本研究中檢出的豬非典型性瘟病毒（SC株）NS2基因序列與所有APPV基因參考序列均處于同一分支，與其他APPV核苷酸序列的同源性在92%以_上。SC株與中國報道的APPV的親緣關(guān)系較近，與國外報道的APPV的親緣關(guān)系較遠。且與CSFV、BDV及BVDV均不在同一分支內(nèi)。

3 討論

豬非典型性瘟病毒（APPV）是中國最近幾年才檢測出的一種新病毒。人工感染試驗證實APPV是一種可以引起A-I型仔豬先天性震顫的病原9]。感染該病毒的仔豬四肢、頭部或全身出現(xiàn)有節(jié)奏的震顫[16]，強烈的重復性震顫使仔豬無法尋找乳頭，導致仔豬母乳攝入不足，嚴重時會導致仔豬死亡。如果護理得當，大多數(shù)仔豬斷奶后震顫現(xiàn)象自行消失以。中國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模龐大，在受影響的養(yǎng)殖場中發(fā)現(xiàn)約1%～2%的流行率，由于養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)模和100%淘汰率，AP-PV造成了極大的經(jīng)濟損失[8]，促使我們?yōu)楂F醫(yī)臨床診斷建立一種簡單快速的檢測方法。

本試驗根據(jù)GenBank中已發(fā)表的APPVNS2基因序列，設計了1對特異性引物并且成功建立了一種APPV的RT-PCR快速檢測方法。特異性試驗結(jié)果表明，本研究建立的方法可以特異性地從樣品中檢測出APPV，而與PRRSV、PRV和CSFV等病原無交叉反應，具有較高的特異性。敏感性試驗結(jié)果表明，建立的RT-PCR檢測方法的最低檢出量為1 μl4.95x104拷貝。為驗證該方法的穩(wěn)定性，本研究進行了組間、組內(nèi)重復性試驗，結(jié)果表明該方法具有良好的重復性。對采自四川省遂寧、邛崍等地區(qū)的68份疑似患病樣品進行檢測，共有5份檢測結(jié)果為陽性，陽性檢出率為7.35%。同時，我們根據(jù)陽性產(chǎn)物測序結(jié)果利用Mega7.0繪制APPV的系統(tǒng)進化樹[17]，發(fā)現(xiàn)本研究檢測的APPV SC株與其他APPV核苷酸序列的同源性在92%以上，SC株與中國報道的APPV的親緣關(guān)系較近，并且國內(nèi)大部分APPV分離株與國外分離株位于不同分支，表明國內(nèi)的APPV的生物學特性、致病性等與國外分離株可能有所區(qū)別。以上試驗結(jié)果均表明，本試驗研究建立的APPV RT-PCR檢測方法可應用于臨床APPV的診斷、檢測和流行病學調(diào)查，為今后開展APPV的深入研究提供了技術(shù)手段，有廣闊的應用前景。

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