M342抗除草劑基因CAPS標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用

程麗　胡茂龍　浦惠明　龍衛(wèi)華　高建芹　陳鋒　周曉嬰　張維　陳松　張潔夫

摘要：M342是利用EMS誘變定向選育獲得的甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑新種質(zhì)。通過M342抗性基因與敏感型油菜的ALS基因序列分析結(jié)果表明，M342的BnALS3基因存在1處SNP突變，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)第556位色氨酸突變?yōu)榱涟彼?，該突變?dǎo)致基因序列對BsrDI內(nèi)切酶消化的差異。為此設(shè)計了8條引物，從中篩選到引物對SU54F/SU58R在不同油菜品種中可以特異性擴(kuò)增出目的片段，該片段經(jīng)BsrDI酶切分型正確，從而開發(fā)了檢測M342中抗性基因BnALS3R的CAPS標(biāo)記。運(yùn)用該標(biāo)記對除草劑敏感型油菜純合抗性油菜及雜合抗性油菜BnALS3的基因型進(jìn)行驗證，并應(yīng)用該標(biāo)記對F、BC分離群體進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，該標(biāo)記驗證的基因型結(jié)果與測序結(jié)果一致。F分離群體有Als3Als3、Als3als3、als3als3 3種基因型，BC分離群體有Als3als3、als3als3 2種基因型，與表型鑒定結(jié)果一致，遵循單基因遺傳分離規(guī)律，表明該標(biāo)記可以應(yīng)用于抗性基因的檢測。CAPS標(biāo)記的獲得為抗除草劑油菜的分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油菜;磺酰脲類除草劑;乙酰乳酸合酶;酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS）標(biāo)記

中圖分類號：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0241-07

有效治理田間雜草是油菜實現(xiàn)機(jī)械化、輕簡化生產(chǎn)的一個重要環(huán)節(jié)，化學(xué)除草是目前控制農(nóng)田雜草最有效的手段?；酋ｋ澹⊿ulfonylurea，SU）類除草劑因其具有高效低量，對動物無害，高選擇性，土壤殘留期短等優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用于水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestium L）、玉米（Zea mays）等單子葉作物田間雜草的防除”。油菜（Brassica napus L.）為雙子葉植物，對商業(yè)化的磺酰脲類除草劑敏感，選育抗SU類除草劑的油菜新品種，拓寬現(xiàn)有SU類除草劑的應(yīng)用范圍，是油菜田間雜草治理經(jīng)濟(jì)有效的途徑。

SU類除草劑屬于乙酰羥基酸合酶（AHAS）抑制劑類除草劑，作用靶標(biāo)是AHAS。AHAS也叫乙酰乳酸合酶（ALS），是植物支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）生物合成過程中的關(guān)鍵酶。除SU類外，ALS類除草劑還包括咪唑啉酮類（Imidazolino-nes，IMIl）、三唑嘧啶磺酰胺（Triazolopyrimidines，TZ）、嘧啶水楊酸類（Pyrimidyloxy-benzoates，PB）和磺酰氨羧基三唑啉酮類（Sulfonlyaminocarbonyl-tri-azolinones，SCT）等。這類除草劑的殺草機(jī)理是除草劑分子與ALS形成復(fù)合物阻斷底物進(jìn)入酶活性位點(diǎn)通路，抑制ALS活性，導(dǎo)致支鏈氨基酸合成受阻，生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成被破壞，使植物失綠、黃化，最后逐漸死亡。植物產(chǎn)生抗性是由于其ALS基因發(fā)生了若干堿基位點(diǎn)的突變，造成編碼蛋白質(zhì)氨基酸殘基位點(diǎn)變異，從而改變除草劑與ALS的結(jié)合方式產(chǎn)生抗性。在已發(fā)現(xiàn)的抗性突變體中，主要涉及8個ALS氨基酸位點(diǎn)突變，這8個位點(diǎn)分別是Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654[以擬南芥（Arabidopsisthaliana）的ALS氨基酸位置計算]，其中對SU類除草劑產(chǎn)生抗性的氨基酸突變位點(diǎn)主要有Pro197、Ala205和Trp574。在油菜中，Swanson等通過誘變油菜小孢子獲得了對IMI類除草劑具有抗性的油菜P1和P2。P1的抗性突變位點(diǎn)是BnALSI的Ser653Asp，P2的抗性突變位點(diǎn)是BnALS3的Trp574Leu。Magha等在培養(yǎng)油菜原生質(zhì)體后代時發(fā)現(xiàn)突變體RCS-5對SU類和IMI類除草劑具有抗性，但未揭示突變位點(diǎn)。有研究者在大豆（Glycinemax）和油菜輪作的試驗田中發(fā)現(xiàn)1株抗IMI類除草劑油菜M9，并揭示了M9的突變位點(diǎn)為BnALSI的Ser653Asp。浦惠明等利用EMS誘變和定向選育技術(shù)，獲得了抗SU類除草劑的甘藍(lán)型油菜突變體M342。M342在苯磺隆推薦使用質(zhì)量濃度下無任何藥害癥狀，仍能正常生長。胡茂龍等進(jìn)一步通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆得到M342抗性基因，突變位點(diǎn)為BnALS3的Trp574Leu。根據(jù)該突變體BnALS3的突變位點(diǎn)，開發(fā)檢測油菜抗SU類除草劑性狀的分子標(biāo)記，通過標(biāo)記快速區(qū)分油菜中抗性基因的基因型，指導(dǎo)油菜抗性育種，加快選育進(jìn)程。

酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved amplified poly-morphic sequence，CAPS）是通過設(shè)計特異性引物擴(kuò)增出目的片段，然后通過限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，電泳檢測不同大小的酶切片段來檢測基因型的技術(shù)。CAPS標(biāo)記是PCR和RFLP（Restrictionfragment length polymorphism）的有機(jī)結(jié)合，該方法快速直觀，避免了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一繁瑣步驟，又能保持RFLP分析的精確度，且是共顯性標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于靶基因突變導(dǎo)致的抗性植株的檢測。然而，在油菜中利用CAPS標(biāo)記檢測抗除草劑的突變基因還鮮見報道。本研究以M342抗性突變體為材料，開發(fā)能快速準(zhǔn)確檢測抗性基因BnALS3R基因型的CAPS標(biāo)記，為油菜抗除草劑分子輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

M342、M294-2等純合抗性材料是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所油菜研究室在EMS誘變體庫中通過非選擇性除草劑大群體定向篩選或通過與M342雜交回交轉(zhuǎn)育獲得，寧油20號，N131、D1-2、D3-1等敏感材料，MICMS雙低恢復(fù)系N221、N340和N341由本研究室保存。

高保真性DNA聚合酶KOD-Plus及PCR試劑購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，克隆載體pEASY-1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、普通TaqDNA聚合酶、dNTPMixture、10XExTaq Buffer PCR、PCR產(chǎn)物平末端加A試劑盒均購自TaKaRa生物工程有限公司（中國大連）。大腸桿菌E.coli DH5a由本實驗室保存。引物合成、DNA測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。BsrDI限制性內(nèi)切酶（NEB）購于南京偉沃生物科技有限公司。苯磺隆除草劑為江蘇省激素研究所股份有限公司生產(chǎn)的10%苯磺隆可濕性粉劑。

1.2 CAPS標(biāo)記開發(fā)

利用EMS誘變和定向選育技術(shù)，我們獲得了甘藍(lán)型油菜抗SU類除草劑突變體M342，該突變體是BnALS3基因起始密碼子第一個核苷酸下游的+1667位點(diǎn)單堿基G突變?yōu)門，導(dǎo)致第574位色氨酸突變?yōu)榱涟彼幔ㄒ詳M南芥的ALS氨基酸位置計算）。隨后，運(yùn)用PrimerPremier5分析了M342和野生型油菜N131之間酶切位點(diǎn)的差異，發(fā)現(xiàn)野生型油菜N131的BnALS3基因+1667位點(diǎn)的堿基G與其上游+1662至+1666的5個堿基構(gòu)成的核苷酸序列“GCAATG”是限制性內(nèi)切酶BsrD I的識別剪切位點(diǎn)。為明確該序列在多個敏感型油菜品種中的保守性，設(shè)計了引物對A1（表1），采用CTAB法對敏感型油菜寧油20號、N221、N340和N341提取DNA，PCR克隆4個油菜品種的BnALS3基因。PCR反應(yīng)體系包含1.0μlDNA模板、2.0μl10x酶反應(yīng)緩沖液、1.2μl25mmol/LMgSO4、2.0μl2mmol/LdNTPs.0.8μl1U/LKOD-PlusTaq酶、13.0μlH20。反應(yīng)程序94C預(yù)變性5min;94C變性30s，55C退火30s，72C延伸2min，35個循環(huán);72C延伸5min。按照試劑盒使用說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行平末端加A后，用1%（質(zhì)量體積比）的瓊脂糖凝膠電泳回收純化，回收片段連接pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ar，挑取陽性克隆測序。

甘藍(lán)型油菜AC基因組有3個ALS功能基因，其中C基因組上的BnALSI和A基因組上的BnALS3在核酸和蛋白水平同源性達(dá)98%，為了避免不同油菜品種BnALSI對抗性基因檢測的干擾，設(shè)計引物對A2，同樣對寧油20號、N221、N340和N341的BnALSI基因進(jìn)行克隆、測序。利用DNA-MAN V6軟件分析M342、N131、寧油20號、N221、N340和N341的BnALSI、BnALS3基因序列差異，在BnALS3基因+1662～+1667序列的兩端設(shè)計了8條引物（表1），正反引物分別錨定在BnALSI、BnALS3核苷酸差異序列上，以期特異性擴(kuò)增BnALS3基因片段。接著以M342的5個單株，上述5種除草劑敏感型油菜（N131、寧油20號、N221、N340和N341）以及M342的5個單株為父本與上述5種除草劑敏感型油菜為母本雜交的F，為材料，提取油菜基因組DNA，使用上述8條引物組合成的16對引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：20ngDNA，0.5μmol/L引物，1x酶反應(yīng)緩沖液，1.5mmoL MgCl，0.2mmol/LdNTP，0.5UTaq酶。PCR擴(kuò)增程序為：94C預(yù)變性5min;94C變性30s，55C退火30s，72C延伸45s，共35個循環(huán);72C延伸5min，4C保存。PCR產(chǎn)物一部分純化測序，一部分用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，25.0μl酶切反應(yīng)體系包括：PCR產(chǎn)物5.0μl，10x酶反應(yīng)緩沖液2.5μl，內(nèi)切酶0.5μl，水17.0μl。65C下反應(yīng)3～5h。用1.5%（質(zhì)量體積比）的瓊脂糖凝膠檢測酶切產(chǎn)物。

1.3 CAPS標(biāo)記的驗證

對抗性油菜M294-2、敏感型油菜D1-2和抗性油菜M305、M306與敏感型油菜D42.D162雜交的F，及親本種子進(jìn)行萌發(fā)。7d后，取適量幼苗提取DNA，并用1%（體積質(zhì)量比）的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA濃度和純度。引物對SU54F/SU58R擴(kuò)增出目的片段，并用BsrD I進(jìn)行酶切，驗證CAPS標(biāo)記。DNA提取、PCR反應(yīng)、酶切分型方法同方法1.2。

1.4 應(yīng)用CAPS標(biāo)記檢測油菜分離群體中BnALS3R的基因型

用MICMS雙低恢復(fù)系N221與M342配制F播種F套袋自交后得到F群體，F(xiàn)單株分別與N221進(jìn)行回交獲得BC群體。當(dāng)年秋季種植F、BC分離群體材料，待油菜生長至3到5葉期，噴施質(zhì)量濃度為45g/hm（a.i）的苯磺隆鑒定分離群體中各單株除草劑抗性噴藥前取適量F、BC分離群體單株和親本的葉片保存于-20C，用于DNA提取。利用引物對SU54F/SU58R擴(kuò)增出目的片段，并用BsrD I酶切分型。DNA提取，PCR反應(yīng)、酶切分型方法同方法1.2。

2結(jié)果與分析

2.1 油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的CAPS標(biāo)記

利用A1引物PCR克隆獲得了敏感型油菜寧油20號、N221、N340和N341的BnALS3基因序列。序列比對發(fā)現(xiàn)，在+1662～+1667位點(diǎn)的6個核苷酸序列均為“GCAATG"，與野生型油菜N131相同，表明該序列在敏感型油菜中具有高度保守性。16對引物分別對多個油菜品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，多次PCR，擴(kuò)增結(jié)果表明，有些引物對無PCR產(chǎn)物，有些引物對PCR非特異擴(kuò)增出多個條帶，不利于進(jìn)行酶切反應(yīng)。其中引物對SU54F/SU58R能特異性擴(kuò)增出目的條帶，該條帶經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)屬于BnALS3基因片段，在敏感型和抗性油菜中存在G/T突變位點(diǎn)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)BsrDI酶切后顯示，抗磺酰脲類除草劑油菜M342的5個單株均為只有1條766bp的條帶，敏感型油菜N131、寧油20號、N221、N340和N341均為含有570bp.196bp2條條帶，F(xiàn)均為含有766bp、570bp和196bp3條條帶（圖1）。田間苗期油菜噴施苯磺隆后，未發(fā)現(xiàn)M342及雜交F，單株死亡，但5種敏感型油菜噴藥20d后全部死亡。上述結(jié)果表明，從16對引物篩選出的引物對SU54F/SU58R可以作為抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的CAPS標(biāo)記引物，該CAPS標(biāo)記可以準(zhǔn)確檢測出油菜種質(zhì)資源中是否含有抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R。

2.2 CAPS標(biāo)記在油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R中的驗證

利用CAPS標(biāo)記對不同油菜的抗性基因

BnALS3R進(jìn)行檢測，結(jié)果表明M294-2、M295-1、M296-1、M297-1、M298-1、M299-1、M300-1、M301-1、M303-1、M304-1、M305-1、M306-2、M307-1是純合抗性油菜，酶切產(chǎn)物只有1條分子量為766bp的條帶;D1-2、D3-1、D4-1、D7-1、D8-2、D9-1、D10-2是敏感型油菜，酶切產(chǎn)物分別有570bp、196bp的2條條帶（圖2），該CAPS標(biāo)記的檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。

純合抗性油菜M305、M306的CAPS標(biāo)記檢測結(jié)果表明只有1條766bp的條帶，敏感型油菜D42、D162的酶切結(jié)果顯示570bp和196bp2條條帶（圖3），均與其基因型結(jié)果一致。分別將M305、M306與D42、D162進(jìn)行雜交，雜交后代F，基因型是雜合型，以F，幼苗的DNA為模板，擴(kuò)增片段酶切后分別有766bp、570bp和196bp3條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。

2.3 應(yīng)用CAPS標(biāo)記檢測油菜分離群體BnALS3R的基因型

利用CAPS標(biāo)記技術(shù)對F、BC群體進(jìn)行檢測，結(jié)果表明F群體CAPS標(biāo)記呈現(xiàn)3種基因型條帶（圖4），即酶切產(chǎn)物為766bp1條條帶，為抗磺酰脲類除草劑Als3Als3純合抗性植株，如單株4～8;酶切產(chǎn)物為766bp、570bp和196bp3條條帶，為Als3als3雜合抗性植株，如單株9～18;酶切產(chǎn)物為570bp和196bp2條條帶，為als3als3純合敏感植株，如單株19～23，CAPS標(biāo)記分析結(jié)果與抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R基因型測序結(jié)果一致。BC群體CAPS標(biāo)記分析呈現(xiàn)2種基因型條帶（圖5），即酶切產(chǎn)物為766bp、570bp和196bp3條條帶，為雜合抗性Als3als3植株，如單株4～13;酶切產(chǎn)物為570bp和196bp2條條帶，為敏感als3als3植株，如單株14～23。以上2個群體CAPS標(biāo)記結(jié)果與苗期噴施苯磺隆表型鑒定結(jié)果一致，并且F和BC群體的CAPS標(biāo)記結(jié)果遵循孟德爾單基因遺傳分離規(guī)律，因此該CAPS標(biāo)記可以有效地檢測分離群體BnALS3R的基因型。

3 討論

傳統(tǒng)的育種方式主要是根據(jù)表型進(jìn)行選擇，而環(huán)境條件、基因間互作、基因型等多種因素會影響對植株的選擇，育種周期較長。分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)可以提高育種的準(zhǔn)確性和效率，在農(nóng)業(yè)育種中發(fā)揮重要的作用。理想的分子標(biāo)記能在廣泛的遺傳背景下有效追蹤目標(biāo)基因，重復(fù)性高。CAPS標(biāo)記技術(shù)將PCR擴(kuò)增和酶切反應(yīng)相結(jié)合，具有操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于植物抗除草劑基因的檢測。運(yùn)用CAPS標(biāo)記技術(shù)，Massa等檢測了阿披拉草（Apera spica-renti）ALS基因Pro197突變體。Yu等對野麥草（Hordeum lepo-rinum Link.）ALS基因Pro197突變體基因檢測，隨后對硬直黑麥草（Lolium rigidum Gaud.）ALS基因Pro197、Trp574突變體進(jìn)行基因分型。鄧維運(yùn)用CAPS標(biāo)記快速檢測播娘蒿（DescurainiasophiaL.）ALSI或ALS2的Pro197、Asp376和Trp574突變體。然而，由于在播娘蒿中ALSI、ALS2基因同源性達(dá)到了96.4%，設(shè)計的引物可同時擴(kuò)增出ALSI、ALS2，但酶切無法明確區(qū)分Pro197突變體究竟是ALSI還是ALS2基因位點(diǎn)的突變。甘藍(lán)型油菜是由白菜型油菜和甘藍(lán)天然雜交形成的異源四倍體，包括A、C基因組，基因組內(nèi)3個具有催化功能的ALS基因核酸序列高度同源，尤其是ALSI和ALS3，同源性達(dá)到98%，這為開發(fā)檢測抗SU類除草劑油菜抗性基因BnALS3R的分子標(biāo)記增加了難度。本研究通過克隆比對BnALSI和BnALS3序列差異設(shè)計出8條引物，從組合的16對引物中篩選出1對引物（SU54F/SU58R）能特異擴(kuò)增出不同油菜品種中與BnALSI高度同源的BnALS3R基因片段，且酶切分型正確，為利用抗性基因進(jìn)行油菜抗除草劑分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)外至今還未有培育出商業(yè)化的抗SU類除草劑油菜品種的公開報道，主要原因是缺少抗性種質(zhì)。因此，篩選鑒定具有生產(chǎn)應(yīng)用價值的抗SU類除草劑油菜新種質(zhì)成為迫切需要。Magha等發(fā)現(xiàn)突變體RCS-5對SU類和IMI類除草劑具有抗性，但未揭示抗性位點(diǎn)。Li等通過篩選EMS突變后代群體鑒定出幾株抗苯磺隆突變體，其突變位點(diǎn)為BnALS3第197位Pro突變?yōu)镾er/Leu。曲高平等報道在3x10*株的EMS誘變M2群體中篩選到K1、K4、K5共3株苯磺隆抗性突變體，隨后揭示了突變體K1、K4均為BnALS3第535位堿基C突變?yōu)閴A基T導(dǎo)致BnALS3第197位Pro突變?yōu)镾er，K5為BnALSI第544位堿基C突變?yōu)閴A基T導(dǎo)致BnALSI第197位Pro突變?yōu)镾er，并開發(fā)了SNP標(biāo)記用于檢測3株突變體基因。通過定向選育方法，我們篩選到抗SU類除草劑油菜M342，該突變體是BnALS3第1667位堿基G突變?yōu)閴A基T導(dǎo)致第574位Trp突變?yōu)長eu，這為抗除草劑油菜種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育奠定了基礎(chǔ)。本研究根據(jù)BnALS3基因Trp574突變位點(diǎn)的SNP，開發(fā)了油菜抗sU類除草劑性狀的CAPS標(biāo)記，該標(biāo)記在分離群體中可以準(zhǔn)確地鑒定純合抗性油菜、純合敏感油菜及雜合抗性油菜BnALS3R的基因型。同時，該標(biāo)記是根據(jù)基因的核苷酸突變特性設(shè)計的功能性基因標(biāo)記，能直接反映植株的抗性，不存在由于遺傳交換而造成的錯誤鑒定，極大地提高了抗性基因的選擇效率。利用該標(biāo)記可以在油菜任何時期鑒定抗性基因純合型單株以及優(yōu)良性狀的敏感單株，淘汰其他單株，這樣不僅可以節(jié)約田間育種成本，而且可以大大提高抗除草劑油菜品種的選擇進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)：

[1]張敏恒.磺酰脲類除草劑的發(fā)展現(xiàn)狀、市場與未來趨勢[J].農(nóng)藥，2010，49（4）：235-245.

[2] MCCOURT J A，DUGGLEBY R G. Acetohydroxyacid synthase

and its role in the biosynthetic pathway for branched-chain aminoacids[J]. Amino Acids，2006，31（2）：173-210.

[ 3] MCCOURT J A，PANG S S，KING-SCOTT J，et al. Herbicide-

binding sites revealed in the structure of plant acetohydroxyacidsynthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，2006，103（3）：569-573.

[4] SADA Y，UCHINO A. Biology and mechanisms of sulfonylurea re-sistance in Schoenopletiella juncoides，a noxious sedge in the rice

paddy fields of Japan[ J]. Weed Biology and Management，2017，17（3）：125-135.

[5] DENG W，YANG Q，ZHANG Y Z，et al. Cross-resistance pat-

terns to acetolactate synthase （ALS ）-inhibiting herbicides offlixweed （Descurainia sophia L. ）conferred by different combina-tions of ALS isozymes with a Pro- l97-Thr mutation or a novel Trp-574-Leu mutation [ J]. Pesticide Biochemistry & Physiology ，2017，136：41-45.

[6] LEE H，RUSTGIS，KUMAR N，et al. Single nucleotide mutation in the barley acetohydroxy acid synthase （AHAS）gene confers re-sistance to imidazolinone herbicides[J]. Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（21）：8909-8913.

[7] HU M L，PU H M，KONG L N，et al. Molecular characterization

and detection of a spontaneous mutation conferring imidazolinoneresistance in rapeseed and its application in hybrid rapeseed pro-duction[ J]. Molecular Breeding，2015，35（1）：46.

[8] LI J，LI M，GAO X X，et al. A novel amino acid substitution

Trp574Arg in acetolactate synthase （ALS）confers broad resistanceto ALS-inhibiting herbicides in crabgrass （Digitaria sanguinalis ）[J]. Pest Management Science，2017，73（12）：2538-2543.[9] TRANELP J，WRIGHTT R，HEAP I M. Mutations in herbicide-

resistant weeds to ALS inhibitors[ DB/OL]. [ 2018-09-15]. ht-tp：// www.weedscience.com/ Mutations/ MutationDisplayAll.aspx.

[ 10] SWANSON E B，COUMANS M P，BROWNG L，et al. The char～-

acterization of herbicide tolerant plants in Brassica napus L. after invitro selection of microspores and protoplasts[J]. Plant Cell Re-ports，1988，7（2）：83-87.

[ 11] SWANSON E B，HERRGESELL M J，Amoldo M，et al. Micro-

spore mutagenesis and selection：Canola plants with field toleranceto the imidazolinones [ J ]. Theoretical and Applied Genetics，1989，78（4）：525-530.

[12] MAGHA M I，GUERCHE P，BREGEON M，et al. Characteriza-

tion of a spontaneous rapeseed mutant tolerant to sulfonylurea andimidazolinone herbcides[ J]. Plant Breeding，2010，111 （2）：132-141.

[13]高建芹，浦惠明，戚存扣，等.抗咪唑啉酮油菜種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與鑒定[J].植物遺傳資源學(xué)報，2010，11（3）：369-373.

[14]胡茂龍，浦惠明，高建芹，等.油菜乙酰乳酸合成酶抑制劑類除

草劑抗性突變體M9的遺傳和基因克隆[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（20）：4326-4334.

[15] 浦惠明，胡茂龍，高建芹，等.一種基于ALS靶酶的抗除草劑油

菜定向選育方法：CN 103070068A [P]. 2013-05-01.

[16] 胡茂龍，浦惠明，龍衛(wèi)華，等.一種甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因及其應(yīng)用：CN103266118A [P]. 2013-08-28.

[17] WEILAND J J，YU M H. A cleaved amplified polymorphic se-quence （CAPS ）marker associated with root-knot nematode resist-ance in sugarbeet[ J]. Crop Science，2003，43（5）：1814-1818.

[ 18] LIU WT，YUANGH，DUL，et al. A novel Pro197Glu substitu-tion in acetolactate synthase （ALS）confers broad-spectrum resist-ance across ALS inhibitors[ J]. Pesticide Biochemistry & Physiolo-gy，2015，117：31-38.

[19] MASSA D，KRENZ B，GERHARDS R. Target-site resistance to ALS- inhibiting herbicides in Apera spica-venti populations is con-ferred by documented and previously unknown mutations [ J ] .Weed Research，2011，51（3）：294-303.

[20]任海，呂小紅，杜萌.多抗水稻分子標(biāo)記輔助育種方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017 ，45（19）：154-158.

[21]周麗霞，吳翼，肖勇. 基于SSR分子標(biāo)記的油棕遺傳多樣性分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，48（2）：216-221.

[22]孫大元，周丹華，張景欣，等.廣譜抗源H4中2個主效抗病基因的單基因系構(gòu)建及評價[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，33（1）：1-5.

[23]鄧琳，余小剛，姜朵，等.棉花分子育種研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49（5）：144-150.

[24]王亞琦，孫子淇，鄭崢，等.作物分子標(biāo)記輔助選擇育種的現(xiàn)狀與展望[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018 ，46（5）：6-12.

[25] YU Q，NELSON J K，ZHENG M Q，et al. Molecular characterisation of resistance to AI S-inhibiting herbicides in Hordeum lepori-num biotypes[ J]. Pest Management Science，2007，63（9）：918-927.

[26] YU Q，HAN H P，POWLES S B. Mutations of the ALS gene endowing resistance to ALS-inhibiting herbicides in Lolium rigidumpopulations[ J]. Pest Management Science，2008，64（12）：1229- 1236.

[27]鄧維.抗苯磺隆播娘蒿抗性機(jī)理及抗性突變對乙酰乳酸合成酶功能影響[ D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[28] LIHT，LIJJ，ZHAO B，et al. Generation and characterization of tribenuron-methyl herbicide-resistant rapeseed （Brasscia napus ）for hybrid seed production using chemically induced male sterility[ J]. Tag. theoretical & Applied Genetics. theoretische Und Ange-wandte Genetik，2015，128（1）：107-118.

[29]曲高平，孫妍妍，龐紅喜，等.甘藍(lán)型油菜EMS突變體庫構(gòu)建

及抗除草劑突變體篩選[J].中國油料作物學(xué)報，2014，36（1）：25-31.

[30]孫妍妍，曲高平，黃謙心，等.甘藍(lán)型油菜抗苯磺隆突變體ALS基因分析與SNP標(biāo)記[J].中國油料作物學(xué)報，2015，37（5）：589- 595.