T₁代轉ChIFN-γ基因煙草鑒定及其生長表現(xiàn)

呂赟 李林樺 宋莉 趙德剛

摘 要：雞γ干擾素（ChIFN-γ）是一類具有抗病毒和免疫保護等廣泛生物學活性的禽病防治有效藥物，通過植物生物反應器表達生產(chǎn)是降低其生產(chǎn)成本和擴大臨床應用范圍的重要途徑。為獲得可以利用的ChIFN-γ轉基因煙草生物反應器，本文在對T1代轉ChIFN-γ基因煙草（TP）進行遺傳穩(wěn)定性檢測的基礎上，對其株高、葉片、根系及活力等指標進行測定，探討外源基因表達對受體植物生長發(fā)育的影響。結果表明，TP煙草幼苗在移栽后植株較高，生長較快，葉片較多。株高增長以第7 d時最為明顯，3個株系的相對生長速度分別為野生型（WT）的253.23%、280.12%和260.42%;TP-1、TP-2和TP-3株系葉片數(shù)相對生長速度分別在第28 d、28 d和14 d時達到最大，為WT的117.33%、118.84%和143.79%;在15d時TP株系組培苗的生根數(shù)和根系長分別為WT的9.09倍、7.06倍、5.06倍和2.23倍、2.66倍、2.41倍;水培條件下TP株系具有較高的根系活力，以第10 d時最明顯，分別為WT的1.12、1.44、1.39倍。因此，轉ChIFN-γ基因煙草具有一定的生長優(yōu)勢，未表現(xiàn)出生長抑制現(xiàn)象，研究結果為ChIFN-γ轉基因植物生物反應器的進一步應用研究提供了依據(jù)。

關鍵詞：ChIFN-γ基因;轉基因煙草;生長發(fā)育;根系活力

中圖分類號：Q786

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）02-0075-05 ? ? 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.02.013

Abstract：Chicken interferon-gamma （ChIFN-γ） is an effective therapeutic for poultry disease prevention and treatment with broad biological activities such as antiviral and immune protection. Through plant bioreactor expression of ChIFN-γ gene is an important way to reduce its production cost and expand its clinical application range. In order to obtain a usable bioreactor in ChIFN-γ transgenic tobacco， based on the genetic stability test of T1 generation of ChIFN-γ transgenic tobacco （TP）， the height， leaf， root and vigor of the plants were measured to examine the influence of exogenous gene expression on the growth and development of recipient plants. The results showed that TP tobacco seedlings had higher plant height， faster growth rate and more leaves after transplanting. The increase of plant growth rate is most obvious on the 7th day. The relative growth rates of the three TP tobacco lines TP-1， TP-2 and TP - 3 were 253.23%， 280.12% and 260.42% times of the wild type （WT）， respectively. The relative growth rate of leaves reached the maximum at 28 d， 28 d and 14 d for TP - 1， TP - 2 and TP - 3 tobacco lines， respectively， and were 117.33 %， 118.84% and 143.79% times of of the WT. At 15 d， the number of roots for the tissue culture seedlings of the three TP tobacco lines were 9.09， 7.06 and 5.06 times of the WT， respectively， and the root length was 2.23， 2.66 and 2.41 times of the WT， respectively. TP tobacco had higher root activity under hydroponic conditions， which was most obvious on the 10th day， being 1.12， 1.44 and 1.39 times of the WT， respectively. The study indicated that ChIFN-γ transgenic tobacco certainly had growth advantages and showed no growth inhibition. The results provide a basis for the further application of ChIFN-γ transgenic plant bioreactor.

Key words：ChIFN-γ gene; transgenic tobacco; growth and development; root vitality

雞γ干擾素（Chicken gamma interferon，ChIFN-γ）是由T淋巴細胞經(jīng)過活化后在誘生劑感化下出現(xiàn)的一類動物細胞因子和巨噬活化因子，不但對DNA和RNA病毒有抑制作用[1]，還具有較強的免疫調節(jié)活性，通過調節(jié)巨噬細胞、T細胞和B細胞間增強機體免疫功能[2]，在預防和治療各類家禽病毒性傳染病及提高機體免疫機能中具有重要意義。植物是良好的蛋白表達系統(tǒng)，作為生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白，具有安全有效、成本低廉、蛋白產(chǎn)物活性強等優(yōu)點[3-4]。自從Cardineau 等[5]報道利用植物生物反應器制備疫苗以來，目前利用植物生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白已取得長足發(fā)展，許多藥用蛋白生產(chǎn)已處在臨床或上市階段，如利用胡蘿卜生產(chǎn)人干擾素α-2b[6]、紅花生產(chǎn)胰島素、煙草生產(chǎn)乙肝抗體等[7]。本文利用課題組前期獲得的T1代轉ChIFN-γ基因煙草種子，播種后，對其煙草植株進行生長發(fā)育特性研究，為進一步開發(fā)利用ChIFN-γ煙草生物反應器和利用動物細胞因子進行植物發(fā)育調控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

轉ChIFN-γ基因煙草由貴州大學農業(yè)生物工程研究院創(chuàng)制保存，實驗材料種植于貴州大學轉基因植物試驗示范基地。

1.2 轉基因植株的GUS染色及PCR鑒定

取T1代轉基因煙草（TP）及其野生型親本（WT）葉片，參照廣巧等[8]方法進行GUS組織化學染色和基因組PCR檢測。目的基因ChIFN-γ的檢測引物序列F：5-CTTTTCCTTGTTTCTGCTAC-3、R：5-ATGGTGGGTCAACAAGCTT-3，1%的瓊脂糖凝膠檢測反應產(chǎn)物。

1.3 株高和葉片數(shù)測定

播種的轉ChIFN-γ基因煙草及其野生型親本幼苗移栽到轉基因植物試驗示范基地種植，對移栽的3個TP株系及1個WT株系煙草，每隔7 d 測一次株高和葉片數(shù)，每個株系測定3株植株。

1.4 根系發(fā)育觀察

取同一生長時期和部位的TP株系和WT煙草的幼嫩葉片，用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～5遍，再用0.1%升汞消毒8 min，無菌水沖洗3～5遍依次滅菌后，分別接種在0.2 mg/L IBA和0 mg/L IBA的生根培養(yǎng)基中后，置于溫度為（25±2）℃，光照強度為15000 LX的環(huán)境中，按12 h/d光照時間培養(yǎng)15 d。每個株系測3株，重復3次。每天觀察和記錄煙草根系發(fā)育情況。根長用刻度尺（精度為0.1 mm）測量，生根數(shù)和根長計算按如下公式計算。

生根數(shù)（條）=總根數(shù)/接種總株數(shù)

平均根長（cm）=總根長/生根總數(shù)

1.5 根系活力檢測

取相同生長時期和部位的煙草葉片進行離體水培，待葉片生根后第5 d開始取根尖部位進行根系活力檢測，每個株系測3株，5天測定1次，共測定3次。測定方法采用氯化三苯基四氮唑法（TTC法）[9]，在含三苯基甲臜（TTF）分別為0.025 mg、0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg標準溶液中，以乙酸乙酯為空白對照，得到其OD485值，繪出標準曲線。根據(jù)TTF標準曲線，對不同時期煙草根系活力進行計算，計算公式為：TTC還原強度=TTC還原量（g）/根重（g）·恒溫時間（h）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件計算均值及標準誤差，用SPSS Statistics V21軟件進行差異顯著性分析，用GraphPad Prism 5及Excel 2010繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 轉基因煙草的遺傳穩(wěn)定性

GUS組織化學染色顯示，轉基因煙草植株的葉片組織呈現(xiàn)明顯藍色，而野生型親本對照植株未見任何藍色（圖1A）;ChIFN-γ基因的基因組PCR擴增得到約505 bp大小的條帶，與目標條帶一致，而WT植株則無此帶（圖1B）。因此，GUS報告基因和外源ChIFN-γ基因均穩(wěn)定存在于TP植株中，轉ChIFN-γ基因煙草具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 轉基因煙草的株高和葉片發(fā)育情況

對ChIFN-γ基因TP煙草和WT煙草移栽的株高觀察發(fā)現(xiàn)（圖2A），3個TP煙草株系在移栽后7～42 d株高的相對生長速度明顯高于WT。其中第7 d時最為顯著（P<0.01），3個TP煙草株系植株株高平均相對生長速度分別為1.62%、1.79%、1.67%，依次是WT的253.23%、280.12%和260.42%，TP株系煙草具有較好的生長優(yōu)勢;3個TP煙草株系在14～42 d葉片的平均相對生長速度也明顯高于WT（圖2B），其中TP-1、TP-2和TP-3株系葉片數(shù)的相對生長速度分別在第28 d、28 d和14 d較WT葉片數(shù)生長速度達到最大，分別為1.76%、1.78%、1.22%，依次是WT的117.33%、118.84%和143.79%，其中第14 d時TP-3較WT顯著（P<0.05）。

2.3 轉基因煙草的根系生長發(fā)育情況

對煙草進行根系發(fā)育統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)（圖3，表1），同一時期的TP煙草根系長勢普遍比WT煙草好，分支較多且根系長度長。試驗期內的TP煙草生根數(shù)目均比WT煙草多，無外源IBA時，相同生長階段的TP-1、TP-2、TP-3株系的平均生根數(shù)目分別是3.00條、2.33條、1.67條，分別為WT的9.09倍、7.06倍、5.06倍。在外源IBA（0.2 mg/L）存在的培養(yǎng)基中，3個TP煙草株系的平均生根數(shù)目分別是1.67條、1.67條、1.33條，分別是WT煙草5.06倍、5.06倍、4.03倍。相同生長階段的TP株系煙草具有較高的根系長度，無外源IBA時，3個TP煙草株系的平均長度依次為2.96 cm、3.54 cm、3.21 cm，分別是WT的2.23倍、2.66倍、2.41倍。在有外源IBA（0.2 mg/L）的培養(yǎng)基中，3個TP煙草株系的根系平均長度分別為3.07 cm、2.10 cm、1.63 cm，是WT的3.84倍、2.63倍、2.04倍?？梢?，ChIFN-γ轉基因煙草的根系發(fā)育具有一定優(yōu)勢，并且這種優(yōu)勢不受外源IBA的影響。

2.4 轉基因煙草的根系活力

取煙草葉片進行水培不定根發(fā)育實驗，待葉片生根后第5 d開始取根尖部位進行根系活力檢測，重復三次。根據(jù)標準溶液OD485值分別為0.028、0.056、0.126、0.201、0.294，得到標準曲線如圖4，方程式y(tǒng)=0.0015x-0.0179（R.2=0.9942）。

根系活力統(tǒng)計分析表明（表2），TP煙草根系活力普遍比WT煙草的高，在生根后第5d時，TP-1、TP-2和TP-3株系的根系活力依次為1.11 mg/g·h、1.30 mg/g·h、1.59 mg/g·h，分別為WT的1.34、1.57、1.91倍。第10 d時，3個TP株系株系的根系活力依次為1.65 mg/g·h、2.12 mg/g·h、2.04 mg/g·h，分別為WT的1.12、1.44、1.39倍。隨著根系不斷生長，煙草株系的根系活力逐漸降低，在第15 d時，TP-1、 TP-2和TP-3株系的根系活力依次為0.78 mg/g·h、1.21 mg/g·h、0.98 mg/g·h，分別為WT的1.05、1.63、1.32倍。

3 結論與討論

受體植物正常的生長發(fā)育是轉基因生物反應器得到充分利用的基本前提。本文通過研究轉ChIFN-γ基因煙草的生長特性以探明該基因表達對受體植物煙草生長發(fā)育的影響，為后續(xù)利用植物生物反應器生產(chǎn)ChIFN-γ藥用蛋白提供理論依據(jù)。結果表明，轉ChIFN-γ基因的煙草，同WT型比較具有明顯的生長發(fā)育優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在轉ChIFN-γ基因的煙草的株高、葉片較WT行高，且具有較好的生長根數(shù)和根系長度。同時轉ChIFN-γ基因的煙草生長特性可能與其具有較高的根系活力和良好的根系發(fā)育有關。

植物的生長發(fā)育優(yōu)勢與其生根數(shù)和根系長度存在必然聯(lián)系，有研究表明，根系作為植株養(yǎng)分吸收和運輸?shù)闹饕鞴?，對植物生長發(fā)育起著重要的作用，根系活力則是根系重要的生理指標，不僅影響根系對養(yǎng)分的吸收能力，在某種程度上與植株地上部的生長發(fā)育密切相關[10-13]，Kulaeva等[14]用人干擾素處理煙草和小麥后，發(fā)現(xiàn)植株根系分裂素活性提高，干擾素表現(xiàn)出促進根系細胞分裂和植物生長發(fā)育的作用。當把外源干擾素基因導入受體植物后，也會對植物體的生長發(fā)育產(chǎn)生一定影響。Matvieieva等[15]把人的α-干擾素基因導入生菜中，發(fā)現(xiàn)轉基因生菜的頂端優(yōu)勢被打破，根系分支較多。因此，ChIFN-γ基因能在轉基因植物中穩(wěn)定存在，其表達可促進受體植物的生長發(fā)育。研究結果為ChIFN-γ轉基因植物生物反應器的進一步應用研究提供了依據(jù)。

參考文獻：

[1] 常維山，沈 強，張譯元，等.家禽干擾素的研究進展與應用[J].中國家禽，2011，33（22）：45-48.

[2] 楊文艷，陳書明. γ干擾素在雞傳染性疾病防治中的應用[J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44（S1）：51-54.

[3] 楊 賀. 利用植物生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白的研究[J].吉林農業(yè)，2016（21）：81-81.

[4] 袁 蓓，李京生，吳燕民. 利用植物生產(chǎn)藥用蛋白的進展、局限及應對策略[J].草業(yè)學報，2013，22（4）：283-299.

[5] Curtiss R I C G A. ORAL IMMUNIZATION BY TRANSGENIC PLANTS：US，WO/1990/002484[P].1990.

[6] Luchakivskaya Y，Kishchenko O，Gerasymenko I，et al. High-level expression of human interferon alpha-2b in transgenic carrot （Daucus carota L.）plants[J].Plant Cell Reports，2011，30（3）：407-415.

[7] 劉培磊，李 寧，連 慶，等.利用植物生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白的研究進展[J].生物技術進展，2013，3（5）：309-316.

[8] 廣 巧，宋 莉，趙德剛.低溫脅迫對轉ChIFN-α基因百脈根抗寒生理生化的影響[J].分子植物育種，2015，13（12）：2849-2853.

[9] 白寶璋，金錦子，白 崧，等.玉米根系活力TTC測定法的改良[J].玉米科學，1994，2（4）：44-47.

[10] 李德燕，周運超.馬尾松幼苗生長對鈣濃度的響應[J].中南林業(yè)科技大學學報，2017，37（12）：39-45.

[11] 韓叢蔚，徐程揚，張 青.PP333和TIBA對大葉黃楊根系形態(tài)及根系活力的影響[J].中南林業(yè)科技大學學報，2018，38（7）：45-51，70.

[12] 李小煒，孫 權，白春梅.水肥一體化下不同施肥和灌水量對玉米根系發(fā)育及水分生產(chǎn)率的影響[J].陜西農業(yè)科學，2018，64（1）：1-7.

[13] Saini S，Sharma I，Kaur N，et al. Auxin：a master regulator in plant root development[J].Plant Cell Reports，2013，32（6）：741-757.

[14] Kulaeva O N，F(xiàn)edina A B，Burkhanova E A，et al. Biological activities of human interferon and 2′-5′ oligoadenylates in plants[J].Plant Molecular Biology，1992，20（3）：383-93.

[15] Matvieieva N A， Shakhovskij A M， Kuchuk M V. Features of lettuce transgenic plants with the ifn -α 2b， gene regenerated after Agrobacterium rhizogenes -mediated transformation[J].Tsitologiia I Genetika， 2012， 46（3）：150-154.