miRNA的常用檢測方法研究

李一龍 閔清

摘? ?要：microRNA（miRNA）是一類非編碼RNA，在生物體內(nèi)的產(chǎn)生過程非常復(fù)雜。miRNA在細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡以及腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。一個(gè)miRNA具有調(diào)控多個(gè)基因的功能，多個(gè)miRNA也可以調(diào)控一個(gè)基因，這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNA的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。miRNA的這種特征為解決復(fù)雜疾病提供了新的切入點(diǎn)，成為潛在的癌基因或抑癌基因，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中有效的標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：microRNA;檢測方法;PCR檢測;電化學(xué)

自1993年miRNA被發(fā)現(xiàn)以來，學(xué)者們已經(jīng)找到了1 000種人類的miRNA，這些miRNA調(diào)控著人類近1/3基因的功能，參與了幾乎所有生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)和大多數(shù)疾病的發(fā)病過程。機(jī)體miRNA的異常表達(dá)將導(dǎo)致多種疾病，其中包括惡性腫瘤與神經(jīng)障礙等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA基因多態(tài)性（miRNA polymorphisms）能夠影響miRNA功能，是人類基因組中一類新型的基因功能多態(tài)性[2]。在染色體基因組水平上，單個(gè)核苷酸變異引起的miRNA序列多態(tài)性對miRNA的轉(zhuǎn)錄、形成、輸出及調(diào)控具有重要影響。因此，檢測miRNA在機(jī)體中的表達(dá)水平以及靈敏檢測出單個(gè)核苷酸的變異對疾病診斷及藥物開發(fā)具有非常重要的意義[3]。

1? ? miRNA檢測存在的挑戰(zhàn)

成熟的miRNA的片段較短，在細(xì)胞中的表達(dá)水平普遍低，且家族成員之間通常只有1～2個(gè)堿基的區(qū)別，基于這個(gè)原因，miRNA的精準(zhǔn)檢測在臨床上存在一定的難度和挑戰(zhàn)性。由于miRNA的序列非常短，所以它的降解溫度很低且容易發(fā)生除完全互補(bǔ)配對以外的雜交反應(yīng)，同時(shí)，單個(gè)堿基錯(cuò)配的序列以及miRNA也容易對檢測信號產(chǎn)生干擾，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，也為其準(zhǔn)確檢測增加了難度[4]。因此，miRNA作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物，需要一種快速靈敏、特異性高的檢測方法對其進(jìn)行分析[5]。

2? ? miRNA的常規(guī)檢測手段

隨著miRNA在不同生物中的大量發(fā)現(xiàn)和對其功能的深入研究，miRNA的檢測方法不斷改進(jìn)和完善，新的擴(kuò)增、探針標(biāo)記技術(shù)和檢測技術(shù)不斷被開發(fā)[6]。目前，miRNA檢測一般是基于核苷酸雜交和擴(kuò)增原理，檢測手段主要為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）[7]，Northern印跡（northern-blotting）[8]，微陣列芯片（microarray）[9]，原位雜交以及電化學(xué)等，這些手段需要將miRNA的雜交信號轉(zhuǎn)化為可以測量的信號，從而達(dá)到定量或定性分析的目的。

2.1? Northern印跡

Northern印跡雜交是一種常用的miRNA檢測方法，自1993年lin-4首次作為負(fù)調(diào)控因子被發(fā)現(xiàn)以來一直被研究至今，該方法將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，在適宜的離子強(qiáng)度及溫度條件下，用探針與膜雜交，然后通過探針的標(biāo)記性質(zhì)檢測出雜交體。與傳統(tǒng)DNA探針相比，Northern印跡雜交探針中引入鎖核酸（Locking Nucleic Acid，LNA），為檢測增加了10倍的靈敏度，并改善了錯(cuò)配的特異性檢測。LNA是將核苷酸殘基的一部分核糖上的2’與4’碳通過亞甲基連接在一起形成的剛性結(jié)構(gòu)，作為探針大大提高了雜交序列的熱穩(wěn)定性、雜交效率及測定靈敏度。然而，這種方法的主要缺點(diǎn)之一是LNA是專有技術(shù)，與傳統(tǒng)DNA探針相比，雜交探針的成本可能增加約50倍。

2.2? PCR檢測

PCR是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它利用DNA在體外95 ℃高溫時(shí)變性成單鏈，60 ℃時(shí)引物與單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，加上對DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72 ℃左右）的調(diào)控，能使DNA在PCR儀內(nèi)良好的變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度下進(jìn)行很好地?cái)U(kuò)增。PCR可以被看作生物體外的特殊DNA復(fù)制，其最大的特點(diǎn)是能大幅度增加DNA的量，RT-qPCR更是因?yàn)槠涑杀?、精密度和樣本量之間良好的平衡關(guān)系被看作miRNA檢測技術(shù)中的黃金標(biāo)準(zhǔn)，常用于驗(yàn)證全基因組篩查的結(jié)果，以及篩選與臨床相關(guān)的miRNA亞組。然而，鑒于miRNA研究的廣泛性，將RT-qPCR應(yīng)用于所有這些領(lǐng)域存在著極大的挑戰(zhàn)，特別是考慮到miRNA的來源廣泛和用于從其提取RNA的方法的問題，對于RT-qPCR來說，其結(jié)果的質(zhì)量和可靠性取決于輸入RNA的質(zhì)量，因?yàn)槿魏谓到舛伎赡軐?dǎo)致錯(cuò)誤，這些錯(cuò)誤在逆轉(zhuǎn)錄過程和定量過程中會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大，所以在開始實(shí)驗(yàn)方案的實(shí)際檢測部分之前，進(jìn)行良好的質(zhì)量控制并檢查RNA的完整性非常重要，需要對miRNA樣品進(jìn)行提純處理。由于miRNA的短小性，對PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)存在一定難度，并且其解旋溫度較低，這在一定程度上影響了PCR檢測的靈敏度及準(zhǔn)確性。此外，由于成熟miRNA是pre-miRNA的一段序列，故pre-miRNA的存在同樣會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾，造成假陽性。

2.3? 微陣列芯片（microarray）

與Northern blot印跡檢測相似，miRNA的微陣列分析依賴于目標(biāo)miRNA與互補(bǔ)DNA探針之間的特異性雜交，在固體表面上集成已知序列的捕獲探針，與被測組織或細(xì)胞中大量標(biāo)記的miRNA進(jìn)行雜交，通過檢測相應(yīng)位置的雜交探針，實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測，其與Northern blot印跡檢測的主要區(qū)別在于它是在微陣列技術(shù)中標(biāo)記的miRNA。微陣列技術(shù)是首批能夠同時(shí)從一個(gè)樣品大規(guī)模并行分析數(shù)百個(gè)miRNA的技術(shù)?；趍icroarray的檢測手段可實(shí)現(xiàn)miRNA的高通量測定，在芯片上引入熒光基團(tuán)，例如cy3，cy5等可實(shí)現(xiàn)miRNA的實(shí)時(shí)、定量監(jiān)測。在microarray檢測中引入LNA修飾的核苷酸探針可進(jìn)行體內(nèi)miRNA的原位雜交檢測。Wienholds等利用LNA修飾的探針進(jìn)行原位雜交反應(yīng)，檢測了100余種miRNA在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)，獲得了多種脊椎動(dòng)物中miRNA的表達(dá)譜。

微陣列方法也存在一些固有的缺點(diǎn)，首先，它只是半定量的，并且最適合于比較不同細(xì)胞狀態(tài)之間miRNA的相對表達(dá)水平。因此，該方法需要一些其他形式的驗(yàn)證，例如用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）來量化表達(dá)。其次，微陣列比其他檢測方法動(dòng)態(tài)范圍小，通常會(huì)導(dǎo)致倍數(shù)變化的壓縮，從而低估了miRNA檢測靈敏度的相對變化值。

2.4? 電化學(xué)檢測

電化學(xué)檢測常用到DNA生物傳感器，DNA生物傳感器的工作原理是將單鏈DNA探針固定在工作電極上，再由電極作為信號傳導(dǎo)器，將表面發(fā)生的雜交反應(yīng)以電信號的形式導(dǎo)出，將結(jié)果顯示在電腦上，通過電化學(xué)信號的大小來確認(rèn)miRNA量的多少。生物傳感器的結(jié)構(gòu)包括一個(gè)靶序列識別層和一個(gè)信號換能器，識別層為金電極界面等，通常通過Au-S結(jié)合巰基DNA，將DNA固定在界面上，并特異性地識別靶序列與其雜交。由于DNA大多數(shù)情況的電化學(xué)惰性，需要在電化學(xué)檢測中加入電化學(xué)活性識別組分，通常這些識別組分選擇性地與單鏈DNA或雙鏈DNA作用，再有換能器將雜交過程產(chǎn)生的變化轉(zhuǎn)化為可識別的信號，電化學(xué)DNA傳感器通常通過檢測這些可識別的信號來檢測雜交反應(yīng)的發(fā)生。根據(jù)雜交前后信號量的變化，對靶DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。電化學(xué)方法快速、簡單、靈敏、成本低廉，可對核苷酸的雜交反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，在檢測miRNA方面具有廣泛的應(yīng)用，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著巨大的潛力。

在電化學(xué)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用納米結(jié)構(gòu)的微電極芯片也可以實(shí)現(xiàn)對miRNA的超靈敏檢測，許多電化學(xué)檢測miRNA的方法均采用納米粒子進(jìn)行信號放大，在傳感芯片上固定既可以捕獲miRNA又可以捕獲檢測探針的序，核苷酸酶會(huì)剪切掉未捕獲miRNA靶點(diǎn)的序列以及錯(cuò)配的堿基序列而保留其完全互補(bǔ)雜交的序列。用具有穩(wěn)定可控的高曲率金納米結(jié)構(gòu)（HCAuNSs）的跨規(guī)模生物傳感界面，大大增強(qiáng)了DNA與酶的相互作用。更重要的是，這些分形納米結(jié)構(gòu)有效地克服了相鄰探針在高密度下的聚集，并使探針更容易被目標(biāo)分子接觸。這些分形納米結(jié)構(gòu)具有較高的檢測角度，可抑制相鄰DNA探針之間的核苷酸聚集，并允許靶分子更自由地進(jìn)入。這種納米結(jié)構(gòu)的微電極芯片在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大潛力，避免了復(fù)雜的PCR擴(kuò)增過程，對于單堿基錯(cuò)配具有較高的靈敏度和選擇性。

3? ? 結(jié)語

miRNA基因多態(tài)性能夠影響miRNA功能，是人類基因組中一類新型的基因功能多態(tài)性。在染色體基因組水平上，單個(gè)核苷酸變異引起的miRNA序列多態(tài)性對miRNA的轉(zhuǎn)錄、形成、輸出及調(diào)控具有重要影響。因此，檢測miRNA在機(jī)體中的表達(dá)水平及靈敏區(qū)分單個(gè)核苷酸變異的miRNA序列，對疾病診斷及藥物開發(fā)具有非常重要的意義。近年來，隨著這些小的、非編碼miRNA的生物功能被逐步開發(fā)，對其檢測的方法也不斷涌現(xiàn)出來，miRNA的檢測方法不斷改進(jìn)和完善，新的擴(kuò)增、探針標(biāo)記技術(shù)和檢測技術(shù)不斷被開發(fā)，但是，將miRNA的表達(dá)與miRNA靶標(biāo)關(guān)聯(lián)用于臨床應(yīng)用具有許多困難和挑戰(zhàn)，最直接的難度源于檢測miRNA靶序列的固有不確定性。目前miRNA檢測一般是基于核苷酸雜交和擴(kuò)增原理，檢測手段主要為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Northern印跡，微陣列芯片，原位雜交以及電化學(xué)檢測等，這些手段需要將miRNA的雜交信號轉(zhuǎn)化為可以測量的信號從而達(dá)到定量或定性分析的目的。然而Northern blotting技術(shù)耗時(shí)長、操作繁瑣、樣品需要量大且靈敏度低;微陣列芯片技術(shù)雖然有高通量的優(yōu)勢，但是會(huì)受到miRNA家族類似序列交叉雜交的干擾，而降低其靈敏度并且需要昂貴的成像儀器;RT-qPCR技術(shù)具有較高的靈敏度和實(shí)用性，但由于miRNA自身的限制，對引物的設(shè)計(jì)要求很高且溫度難以控制。而電化學(xué)生物傳感器具有高效、靈敏、快速、簡便等特點(diǎn)，而且電化學(xué)檢測設(shè)備相對來說裝置輕便、廉價(jià)、低能耗且易于微型化和集成化。因此，基于電化學(xué)技術(shù)的miRNA生物傳感器具有獨(dú)特的優(yōu)勢，在床旁檢測、分子診斷等領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景。

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