ApoE基因敲除小鼠疾病模型的研究進(jìn)展

宋珂　侯彥宏　楊會(huì)　白云綺　李慧　聶波

[摘要] 載脂蛋白E（ApoE）是一種有明顯基因多態(tài)性、多功能蛋白，與脂蛋白的代謝有密切聯(lián)系，其缺失和變異都會(huì)引起體內(nèi)代謝失常及功能紊亂，甚至引起一系列疾病和并發(fā)癥。近年來，ApoE-/-小鼠主要應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)退化性疾病、腎臟病等。為了更好地研究ApoE在各疾病模型中的應(yīng)用機(jī)制，為臨床疾病治療提供更加有力的依據(jù)，本文總結(jié)了人類ApoE基因型與ApoE蛋白相關(guān)的幾種疾病的發(fā)生機(jī)制，并對(duì)體外研究疾病發(fā)展過程的動(dòng)物模型進(jìn)行了綜述。

[關(guān)鍵詞] 載脂蛋白E;基因敲除;動(dòng)物模型;研究進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R332 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）06（c）-0042-04

Advances in research on disease model of ApoE knockout mice

SONG Ke1 ? HOU Yanhong2 ? YANG Hui3 ? BAI Yunqi1 ? LI Hui3 ? NIE Bo1

1.Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing Key Laboratory， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing ? 100700， China; 2.Research Center for Chinese Medicine Development， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing ? 100700， China; 3.School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing ? 100029， China

[Abstract] Apolipoprotein E （ApoE） is a kind of gene polymorphism and multifunctional protein， which is closely related to the metabolism of lipoprotein. Its deletions and mutations can cause metabolic disorders and dysfunction in the body， and even cause a series of diseases and complications. In recent years， ApoE-/- mice have been mainly used in atherosclerosis， diabetes， neurodegenerative diseases and kidney diseases. In order to better study the application mechanism of ApoE in various disease models and provide a more powerful basis for clinical treatment of diseases， this paper summarizes the pathogenesis of several diseases related to ApoE protein in human ApoE genotype， and summarizes the animal models for in vitro study of disease development process.

[Key words] Apolipoprotein E; Gene knockout; Animal model; Research progress

載脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠，又名ApoE基因缺陷小鼠，于20世紀(jì)90年代被美國洛克菲勒大學(xué)生化遺傳與代謝實(shí)驗(yàn)室和北卡羅萊那大學(xué)病理遺傳實(shí)驗(yàn)室培育成功。此后，其被各國學(xué)者應(yīng)用于各種疾病研究中，以便于人們更好地了解ApoE的功能及其在各類疾病的發(fā)病機(jī)制、臨床治療中的意義?，F(xiàn)就近十年各國學(xué)者的研究進(jìn)行綜述。

1 載脂蛋白E概述

ApoE是乳糜微粒（CM）、極低密度脂蛋白（VLDL）、高密度脂蛋白（HDL）的重要組分，可調(diào)節(jié)膽固醇和脂蛋白代謝。同時(shí)，ApoE在調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)、信號(hào)傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝等方面具有重要作用[1]。

ApoE基因的多態(tài)性于20世紀(jì)中葉被Utermann等發(fā)現(xiàn)，其由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，并構(gòu)成了ε2、ε3、ε4三個(gè)等位基因，目前已成為各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)。ApoE基因多態(tài)性促使糖脂代謝紊亂。Larifla等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ε4攜帶者的總膽固醇（TC）水平高于ε2攜帶者。ApoE基因多態(tài)性與心血管疾病有關(guān)，ε4等位基因是2型糖尿?。═2DM）和腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。Singh等[4]認(rèn)為攜帶ε2等位基因的患者易患氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心臟損傷。ApoE基因多態(tài)性與神經(jīng)性疾病相關(guān)。研究[5]顯示，ApoE ε4攜帶者在許多神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試分?jǐn)?shù)中表現(xiàn)出更快地下降，提示ApoE ε4可作為帕金森疾病中認(rèn)知功能下降速度更快的預(yù)測(cè)因子。因此，ApoE不同的基因表型研究有利于臨床上指導(dǎo)患者正確選擇藥物和干預(yù)治療，為新療法的開發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

2 ApoE基因敲除小鼠疾病模型

2.1 動(dòng)脈粥樣硬化模型

ApoE-/-小鼠是目前動(dòng)脈粥樣硬化研究的經(jīng)典模型，不僅因?yàn)槠鋭?dòng)脈粥樣硬化病變可自發(fā)形成，更重要的是其在病理及組織學(xué)形態(tài)上與人類極其相近，高脂膳食喂養(yǎng)的小鼠是研究動(dòng)脈粥樣硬化的常用動(dòng)物模型之一。雖然ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變可自覺出現(xiàn)，但因不同的高脂飼料配方及造模方式的不同，模型構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)短不一。研究[6]發(fā)現(xiàn)，給予西方飲食（21%脂肪+0.15%膽固醇）喂養(yǎng)12周后，其血脂水平顯著增高，在主動(dòng)脈根部位置，管壁有增厚，斑塊也有明顯增多，表現(xiàn)出典型的動(dòng)脈粥樣硬化病理特征。給予ApoE-/-小鼠高脂飼料（含18%氫化可可脂、0.15%膽固醇、7%酪蛋白、7%蔗糖和3%麥芽糊精）喂養(yǎng)8周后，通過對(duì)小鼠心臟主動(dòng)脈瓣行蘇木精-伊紅（HE）染色，證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化模型制備成功[7]。李瑩瑩等[8]發(fā)現(xiàn)，給予小鼠高脂喂養(yǎng)2周，行右側(cè)頸動(dòng)脈套管術(shù)后8周，發(fā)現(xiàn)其TC、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等明顯升高，頸總動(dòng)脈套管處有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。

2.2 糖尿病模型

糖尿病是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，兩者有密切關(guān)系，均為慢性炎性反應(yīng)[9]。在其疾病研究中應(yīng)用ApoE-/-小鼠作為糖尿病模型的首選。衡先培等[10]發(fā)現(xiàn)，以ApoE-/-小鼠塑造糖尿病模型是比較理想的研究復(fù)合型血管病變的模型。鏈脲佐菌素（STZ）量以小鼠40 mg/kg，早上腹部皮下注射3 d。第3天于注射后48、72 h分別測(cè)定空腹血糖（FBG），若2次FBG≥11.1 mmol/L，即可判定造模成功。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，注射STZ（80 mg/kg）3 d，同時(shí)高糖高脂飼料（15%蔗糖、4%膽固醇、10%豬油、0.3%膽鹽的高脂葡萄糖、10%蛋黃粉、60.7%堿性飼料）喂養(yǎng)8周后，確定造模成功。Getz等[12]認(rèn)為，應(yīng)用最多的西方標(biāo)準(zhǔn)高脂飼料可促使ApoE-/-小鼠的膽固醇指標(biāo)在短期內(nèi)達(dá)到≥38.79 mmol/L。因此。其被用于糖尿病模型制備中，并以西方標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，按比例注射STZ，幾周后觀察血糖水平，符合條件的小鼠被視為造模成功。

2.3 其他模型

胡爽[13]采用2步外科手術(shù)法（即電凝右腎皮質(zhì)，2周后切除左腎）建立尿毒癥模型，術(shù)后2周采集血標(biāo)本，檢測(cè)尿素氮、肌酐，發(fā)現(xiàn)其明顯升高，提示造模成功。研究[14]發(fā)現(xiàn)，可采用皮下埋置Ang Ⅱ膠囊滲透壓泵的方式構(gòu)建ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型。采用相同C57BL/6背景的系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠（Fasl-/-）和ApoE-/-小鼠建立起系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并動(dòng)脈粥樣硬化的模型小鼠，并綜合評(píng)價(jià)其系統(tǒng)性紅斑狼瘡和動(dòng)脈粥樣硬化的主要特征，證明模型成功[15]。咪喹莫特誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠模型具有銀屑病和血脂異常的病理特征，可作為銀屑病和血脂異常綜合征的發(fā)病機(jī)制和藥物治療研究的理想復(fù)合動(dòng)物模型[16]。這些疾病模型的建立，為今后各疾病的臨床應(yīng)用和臨床治療做出了巨大的貢獻(xiàn)。

3 ApoE-/-小鼠的應(yīng)用

3.1 ApoE-/-小鼠在動(dòng)脈粥樣硬化研究中的應(yīng)用

在動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型中，Tregs的激活與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成負(fù)相關(guān)，其作用機(jī)制依賴于Tregs調(diào)節(jié)LC3、Beclin1等自噬/凋亡通路蛋白的表達(dá)[17]。在ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)制備的動(dòng)脈粥樣硬化模型中，miR-152通過靶向KLF5抑制炎性反應(yīng)來減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制[18]。Seifert等[19]發(fā)現(xiàn)，高膽固醇飲食的ApoE-/-小鼠在右頸總動(dòng)脈（CCA）周圍植入錐形袖帶后，與下游更穩(wěn)定的斑塊表型比較，其上游低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MMP-2和MMP-9活性顯著更高。以上研究均提示ApoE-/-小鼠在動(dòng)脈粥樣硬化的自噬、凋亡、炎癥及剪切應(yīng)力等方向的研究均具有重要作用。

3.2 ApoE-/-小鼠在糖尿病研究中的應(yīng)用

胰島素抵抗脂肪細(xì)胞衍生的外泌體通過增加糖尿病ApoE-/-小鼠中的血管滋養(yǎng)血管生成而加重動(dòng)脈粥樣硬化[20]。Brennan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病ApoE-/-小鼠模型中，人脂氧素A4（LXA4）和苯并-LXA4均顯著減弱糖尿病誘導(dǎo)的主動(dòng)脈斑塊和主動(dòng)脈組織炎性反應(yīng)的發(fā)展，包括血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、人單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)。Park等[22]發(fā)現(xiàn)外源性胰島素通過降低高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥、胰島素抵抗和輕度糖尿病ApoE-/-小鼠的炎性細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞和血脂，降低動(dòng)脈粥樣硬化。

3.3 ApoE-/-小鼠在神經(jīng)退化性疾病研究中的應(yīng)用

ApoE不僅可調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)和脂蛋白代謝，還參與了神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和損傷后的修復(fù)過程。姜洋等[23]通過跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)及避暗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知有損害的老年小鼠經(jīng)補(bǔ)腎祛瘀化痰法干預(yù)后，其行為學(xué)表現(xiàn)及認(rèn)知功能都會(huì)有改善。癡呆患者的記憶能力減退的主要原因?yàn)槟憠A能神經(jīng)退化，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）是參與乙酰膽堿（Ach）合成的限速酶，研究[24]顯示，癡呆患者記憶能力下降與ChAT顯著相關(guān)。楊秀麗等[25]研究發(fā)現(xiàn)脂欣康可降低ApoE-/-小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)損傷，加強(qiáng)腦ChAT的表達(dá)，從而改善小鼠認(rèn)知功能。

3.4 ApoE-/-小鼠在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

高脂血癥作為慢性腎臟疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，通過脂質(zhì)代謝紊亂，誘導(dǎo)系膜擴(kuò)張、氧化應(yīng)激、炎癥激活，使腎臟受損。高蛋氨酸飲食的ApoE-/-小鼠模型中，高同型半胱氨酸血癥可通過上調(diào)MMP-9/TIMP-1比例致細(xì)胞外基質(zhì)降解，繼而導(dǎo)致腎臟損傷[26]。倪杰等[27]發(fā)現(xiàn)，高脂血癥可通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腎小管間質(zhì)纖維化、腎臟R動(dòng)脈粥樣硬化系統(tǒng)激活在腎損傷中發(fā)揮重要作用。Shing等[28]應(yīng)用ApoE-/-5/6腎切除建立腎病模型，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)主動(dòng)脈斑塊的形成、血管功能和全身炎癥具有一定的影響，并且可以作為治療動(dòng)脈硬化腎病的的一種非藥物治療方法。

4 討論

目前，ApoE-/-小鼠不僅對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制的研究做出了巨大貢獻(xiàn)，而且還為其他各種疾病的臨床研究和治療提供了更多可靠依據(jù)。然而，其在其他疾病中的應(yīng)用還不完善，而且對(duì)ApoE基因在各病理生理過程中的作用及機(jī)制并不完全清楚，有待進(jìn)一步深入研究。開發(fā)更多ApoE-/-小鼠模型將有助于人類更加熟悉相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，從而找到更為可靠、有效的疾病治療方案。

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