松弛素對脂多糖所致大鼠急性肺損傷肺纖維化的作用*

畢小菁， 王文軍， 代麗， 羅丹， 陳夢晴

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(四川瀘州 646000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)繼發(fā)于各種直接或間接的肺損傷，常導(dǎo)致急性低氧性呼吸衰竭，大多數(shù)患者在臨床上有急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[1]。ALI/ARDS病死率高，有研究表明1984—2006年11月期間ALI/ARDS病死率為44.3%[2]。ALI/ARDS在病理學(xué)上表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷、肺泡-毛細(xì)血管通透性增加，隨著病情進(jìn)展導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎和肺纖維化[3]。有研究表明，纖維增生是ALI的早期反應(yīng)，也是一個重要的治療靶點(diǎn)[4]。因此，研究ALI肺纖維化具有十分重要的臨床價值。松弛素是一種肽類激素，其作用在妊娠和分娩過程中十分重要[5]。同時也參與了高血壓和心力衰竭的病理生理過程，血管生成和骨重建，以及癌癥和纖維化的分子途徑[6-7]。近年來，有研究表明，松弛素抗纖維化性質(zhì)在抗腕管綜合征、腎臟纖維化、肝臟纖維化、心肌纖維化、氣道重構(gòu)等方面都具有一定保護(hù)作用[8-12]。目前國內(nèi)外尚無松弛素治療ALI后肺纖維化的研究報道。因而，本研究從2016年10月至2018年10月，通過探索松弛素在ALI肺纖維化中的作用及其機(jī)制，旨在為ALI肺纖維化患者的臨床治療策略和預(yù)后提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 健康SPF級雄性SD大鼠，周齡7～8周，體重180～200 g,購買于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。重組人松弛素-2(recombinant human relaxin-2)，規(guī)格25 μg/支，購于Peprothch公司。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，規(guī)格10 mg/支，購于Sigma公司。TGF-β1抗體， 規(guī)格 200 μg/mL，購于Santa公司。Samd-2抗體，規(guī)格100 μg/mL，購于Santa公司。

1.2 動物分組及模型制作 將50只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分別為生理鹽水對照組(NS組，n=10)、模型組(LPS組，n=10)、松弛素低劑量組(RLX-L組，n=10)、松弛素中劑量組(RLX-M組，n=10)、松弛素高劑量組(RLX-H組，n=10)。NS組大鼠給予一次性腹腔注射生理鹽水5 mg/kg處理，其余各組大鼠給予一次性腹腔注射LPS 5 mg/kg處理。1 h后NS組及LPS組大鼠開始皮下注射生理鹽水2 μg/(kg·d)，RLX-L組、RLX-M組、RLX-H組大鼠分別開始皮下注射稀釋后的重組人松弛素-2 1、2、4 μg/(kg·d)。連續(xù)給藥14 d。

1.3 標(biāo)本采集 24 h后每組各取大鼠5只，稱重后處死(戊巴比妥鈉160 mg/kg)，暴露胸腔，結(jié)扎氣管，將肺組織與其他組織游離，取下肺組織，用冰鹽水沖洗血管，用無菌吸水紙吸干水分，稱重，即為濕肺重量(mg)，放置于無菌器皿中。用無菌組織剪取右肺中葉浸泡于4%多聚甲醛24 h后用石蠟包埋，備行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色) 。14 d后以同樣的方式處死每組剩余5只大鼠，稱重肺組織，取左肺組織液氮速凍后放置于-80℃冰箱凍存，用于羥脯胺酸含量的檢測；取右肺中葉組織，浸泡于4%多聚甲醛24 h后用石蠟包埋，備行HE染色、Masson染色及免疫組化染色。

1.4 觀察指標(biāo)及測定方法

1.4.1 肺指數(shù) 以濕肺重量(mg)與大鼠體重(g)的比值表示。

1.4.2 羥脯胺酸(hydroxyproline,HP)測定[13]HP是體內(nèi)膠原蛋白的主要成分，我們測量HP含量以反映膠原蛋白的含量，以此反映肺組織纖維化的程度。用比色法測定肺組織HP含量。取100 mg肺組織于含10 mL 6 mol/L HCL水解管中，放置于130℃恒溫干燥箱中水解5 h。用NaOH調(diào)整pH值至6.5～7，用蒸餾水將體積調(diào)為30 mL。取1 mL標(biāo)本溶液與1 mL 0.05 mol/L氯胺T溶液混合，放置室溫下孵育20 min。然后加入1 mL 20%二甲基苯甲醛，放置60℃恒溫水浴中孵育20 min，測定每個樣品在550 nm處的吸光度。結(jié)果用HP(mg)/濕肺重量(g)。

1.4.3 病理學(xué)檢測 用Ashcroft分?jǐn)?shù)[14]半定量評估肺纖維變化。將石蠟包埋的大鼠右肺中葉組織連續(xù)切片，厚度5 μm，然后用二甲苯脫蠟，再由從高濃度到低濃度乙醇進(jìn)行水合，最后入蒸餾水進(jìn)行HE染色和masson染色。每只大鼠制作3張切片，每張切片的嚴(yán)重程度用顯微鏡下纖維化分?jǐn)?shù)表示。肺纖維化分?jǐn)?shù)由0～8分進(jìn)行表示，具體如下：0分表示正常肺組織；1分表示肺泡或支氣管壁最小纖維化增厚；2～3分表示中等程度增厚，但肺組織結(jié)構(gòu)未破壞；4～5分表示肺纖維程度增加伴有一定的肺組織結(jié)構(gòu)損害以及纖維帶或小的纖維團(tuán)塊形成；6～7分表示肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞以及大片纖維化區(qū)域形成，包括蜂窩肺；整個區(qū)域全部纖維化則評為8分。分析每張切片下10個區(qū)域，所有區(qū)域的平均纖維化分?jǐn)?shù)即為這張切片的纖維化分?jǐn)?shù)，每組大鼠所有切片的平均纖維化分?jǐn)?shù)即為該組大鼠纖維化分?jǐn)?shù)。

1.4.4 TGF-β1、Samd-2蛋白表達(dá)測定 用免疫組化法[15]對進(jìn)行TGF-β1、Samd-2蛋白表達(dá)半定量分析。將石蠟包埋的大鼠右肺中葉組織切片，然后用二甲苯脫蠟，再由從高濃度到低濃度乙醇進(jìn)行水合。將切片加入0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中，煮沸10 min進(jìn)行抗原修復(fù)；用組化筆畫圈后將切片滴入3%過氧化氫，室溫下孵育；加入山羊血清封閉液進(jìn)行封閉，室溫下孵育；滴加抗TGF-β1抗體或抗Samd-2抗體，放在4℃冰箱中過夜；第2天，取出濕盒，室溫下復(fù)溫后每張片子加入50 μL鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，再滴加100 μL二氨基聯(lián)苯胺溶液染色，再用蘇木素復(fù)染使細(xì)胞核變?yōu)樗{(lán)色，最后用低濃度到高濃度乙醇脫水。切片晾干后封片，蓋上蓋玻片，晾干后放在顯微鏡下觀察。若蛋白表達(dá)為陽性，則在顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，顏色越深，說明其表達(dá)越強(qiáng)。應(yīng)用Leiea系統(tǒng)對顯微鏡下圖像進(jìn)行采集。應(yīng)用Image-Pro Plus(6.0)圖文分析軟件對采集的圖像進(jìn)行分析。每只大鼠制作3張切片，每張切片隨機(jī)取5個視野(×200),測量每個區(qū)域棕黃色顆粒的累積積分光密度(integral optical density，IOD),每組大鼠所有切片積分光密度的平均值即為該組大鼠平均光密度值(mean of IOD)，作為 TGF-β1、Samd-2蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 肺指數(shù) 在第14天，與NS組相比，LPS組的肺指數(shù)顯著增加(P<0.05)；然而，與LPS組相比，重組人松弛素-2各干預(yù)組大鼠肺指數(shù)明顯降低(P<0.05)。松弛素各干預(yù)組之間相比，RLX-M組與RLX-H組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但兩組與RLX-L組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 HP含量 LPS組肺組織HP含量明顯高于NS組(P<0.05)；與LPS組比較，松弛素各干預(yù)組含量均明顯降低(P<0.05)。松弛素各干預(yù)組之間比較，RLX-L組與RLX-M組之間及RLX-M組與RLX-H組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但RLX-L組與RLX-H組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺指數(shù)、HP含量比較

表1 各組肺指數(shù)、HP含量比較

組別n肺指數(shù)(mg/g)HP(mg/g)纖維化分?jǐn)?shù)(分)NS組57.44±0.191.75±0.730.60±0.55LPS組511.67±0.80?6.44±0.82?7.80±0.45?RLX-L組59.12±0.24?△5.35±0.21?△6.40±0.55?△RLX-M組58.13±0.29?△▲5.08±0.25?△5.20±0.45?△RLX-H組58.03±0.19?△▲4.92±0.12?△▲4.20±0.45?△

*與NS組比較P<0.05；△與LPS組比較P<0.05；▲與RLX-L組比較P<0.05

2.3 HE染色 光鏡下觀察造模后24 h肺組織，NS組大鼠肺組織肺泡壁正常，肺泡腔清晰，肺泡內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤；LPS組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡腔內(nèi)可見出血、滲液，部分肺泡壁塌陷，大量炎癥細(xì)胞浸潤；松弛素各干預(yù)組較LPS組有所減輕，見圖1。14 d NS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，LPS組肺組織正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡間隔斷裂、肺泡融合、肺間質(zhì)可見較多膠原纖維，松弛素各干預(yù)組較LPS組膠原纖維減少、纖維化有不同程度減輕，見圖2。進(jìn)行纖維化評分，NS組肺纖維化評分0～1分，LPS組7～8分，RLX-L組6～7分，RLX-M組5～6分，RLX-H組4～5分，見表1。

2.4 masson染色 NS組肺泡結(jié)構(gòu)完整，僅極少量藍(lán)色膠原纖維沉積。LPS組可見正常肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，肺泡腔及肺泡間隔藍(lán)色膠原纖維彌漫分布；松弛素各干預(yù)組膠原纖維亦較NS組增多，但膠原纖維分布較LPS組均有不同程度減輕，見圖3。

2.5 免疫組化 NS組可見肺泡上皮細(xì)胞有少量 TGF-β1、Smad2 表達(dá)，LPS組肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、炎細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)均有TGF-β1、Smad2陽性表達(dá)，且較NS組明顯增強(qiáng)，而松弛素各干預(yù)組TGF-β1、Smad2表達(dá)均較模型組顯著減弱，見圖4、5。定量分析顯示，LPS組TGF-β1、Smad2 的平均光密度值均明顯高于NS組(P<0.05)，而松弛素各干預(yù)組均明顯低于LPS組(P<0.05)。松弛素各干預(yù)組之間比較，各組TGF-β1平均光密度值均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RLX-L組與RLX-M組之間Smad2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與RLX-H組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

造成ALI/ARDS的原因有很多，比如感染、膠原血管疾病、藥物不良反應(yīng)、休克、急性嗜酸性粒細(xì)胞肺炎、免疫介導(dǎo)的肺出血和血管炎、放射性肺炎等[16]。其中革蘭陰性桿菌感染是引起ALI的常見因素。細(xì)胞壁的LPS是革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素的主要成分，也是最主要的致病因素[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在ARDS患者中，肺纖維化在近期和遠(yuǎn)期預(yù)后中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。本實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射LPS后24 h，大鼠肺組織肺泡壁明顯破壞，炎性細(xì)胞嚴(yán)重浸潤，14 d后LPS組肺泡腔、肺泡間隔彌漫性膠原纖維沉積，肺纖維化評分明顯高于NS組，提示本實(shí)驗(yàn)成功建立了ALI肺纖維模型。

肺纖維化伴有成纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積。機(jī)體發(fā)生肺損傷后，肺成纖維細(xì)胞多種細(xì)胞因子的促進(jìn)下進(jìn)行表型調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[19]。而肌成纖維細(xì)胞因其細(xì)胞外基質(zhì)和纖維化介質(zhì)的高表達(dá)，是肺纖維化組織重塑過程的關(guān)鍵因素[20]。在眾多促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子中，TGF-β1尤為關(guān)鍵[21]。TGF-β1能夠誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，并且可以引起細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的大量合成[19]。有研究表明，TGF-β1介導(dǎo)的Smads通路是纖維化發(fā)生的可能機(jī)制之一[22]， TGF-β1能結(jié)合并激活Ⅰ型TGF-β受體結(jié)合，然后導(dǎo)致Smad2被磷酸化，再轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，最終導(dǎo)致纖維化[23]。本實(shí)驗(yàn)中，LPS組TGF-β1、Smad2 較NS組均明顯表達(dá)，提示TGF-β1、Smad2的參與可能促進(jìn)肺纖維的形成。

A:NS組；B:LPS組；C:RLX-L組；D:RLX-M組；E:RLX-H組

A:NS組；B:LPS組；C:RLX-L組；D:RLX-M組；E:RLX-H組

A:NS組；B:LPS組；C:RLX-L組；D:RLX-M組；E:RLX-H組

A:NS組；B:LPS組；C:RLX-L組；D:RLX-M組；E:RLX-H組

A:NS組；B:LPS組；C:RLX-L組；D:RLX-M組；E:RLX-H組

表2 各組平均光密度值比較

表2 各組平均光密度值比較

組別TGF-β1Smad2NS組3.39±0.394.70±0.38LPS組16.78±3.42?23.46±0.87?RLX-L組10.39±0.50?△21.18±2.46?△RLX-M組8.72±0.44?△▲19.33±2.50?△RLX-H組6.39±0.39?△▲#15.47±0.73?△▲#

*與NS組比較P<0.05；△與LPS組比較P<0.05；▲與RLX-L組比較P<0.05；#與RLX-M組比較P<0.05

有報道[24]，松弛素與1 型松弛素受體結(jié)合后，可促進(jìn)一氧化氮合成的增加，而一氧化氮有抑制Smad2的磷酸化作用，進(jìn)而抑制TGF-β1受體向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖、活化、及分化為肌成纖維樣細(xì)胞，從而起到抑制纖維化的作用。有研究表明，松弛素能減輕TGF-β1誘導(dǎo)的心肌纖維化[25]。另外在一項(xiàng)研究松弛素對腎纖維化的作用的研究中，結(jié)果表明松弛素可通過抑制Smad2的磷酸化，干擾TGF-β1，從而抑制腎纖維母細(xì)胞的分化和抑制膠原的沉積[26]。既往已有研究表明松弛素在抗肺纖維化中也具有一定的作用，即在一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)中，松弛素基因敲除后的小鼠出現(xiàn)顯著的肺膠原沉積，提示松弛素起著抑制肺膠原沉積的重要作用[27]。本實(shí)驗(yàn)中重組人松弛素-2各干預(yù)組肺纖維化程度明顯較LPS組輕，提示松弛素可緩解ALI肺纖維化，且TGF-β1、Smad2在干預(yù)組中的表達(dá)明顯較LPS組弱，提示松弛素可能通過抑制TGF-β1、Smad2減輕ALI肺纖維化。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，重組人松弛素-2可能通過抑制TGF-β1、Samd-2，從而在一定程度上抑制肺纖維化的發(fā)展。這可能是松弛素治療肺纖維化的機(jī)制。但本實(shí)驗(yàn)為動物實(shí)驗(yàn)，僅為松弛素治療肺損傷肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)理論及臨床治療思路，用于治療人類肺損傷肺纖維化還需要更多的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。