植物灰葡萄孢菌生物防治與化學(xué)防治機(jī)理的研究進(jìn)展

肖景惠逄 飛倪瑞琪遲乃玉王夢雨*

（1 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116622；2 遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）是一種世界范圍的植物灰霉病病原菌，能夠侵染植物的根莖、葉片、花和果實(shí)，導(dǎo)致500 多種植物病變，其中農(nóng)作物超過200 種，包括番茄、草莓、葡萄等重要經(jīng)濟(jì)作物（陳鳳平 等，2010；Elad et al.，2016）?；移咸焰呔且环N適宜在低溫、高濕環(huán)境下生長的植物病原菌。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，溫室內(nèi)溫度通常保持在15～20 ℃，具有較高的相對濕度，極易引起灰霉病大范圍的發(fā)生（嚴(yán)玉行和和中岳，2017）。在作物采摘后的貯藏和運(yùn)輸過程中，灰葡萄孢菌會加速其腐爛變質(zhì)，導(dǎo)致嚴(yán)重的物流損失。目前，灰葡萄孢菌的防治手段以施加化學(xué)殺菌劑為主，雖可高效抑制病害，但也易產(chǎn)生抗藥性，長此以往削弱了防治效果（Rupp et al.，2017），且化學(xué)防治手段不利于環(huán)境保護(hù)，殘留藥物會危害人畜健康（何美仙，2004）。

生物防治技術(shù)是通過調(diào)控生物體，利用生物物種間的相互抑制關(guān)系，使植物產(chǎn)生對病原體、害蟲和雜草具有抵抗作用的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)植物抗性的保護(hù)手段。生物防治技術(shù)不會打破生態(tài)平衡且不會產(chǎn)生環(huán)境污染，屬于重要的綠色防治手段，具有廣闊的發(fā)展前途（王亞杰 等，2018）。本文通過對近年來國內(nèi)外防治灰葡萄孢菌的生物、化學(xué)手段的作用機(jī)理進(jìn)行綜述，為今后灰葡萄孢菌的防治研究提供依據(jù)。

1 灰葡萄孢菌

灰葡萄孢菌可產(chǎn)生纖維素酶（cellulase）、果膠酶（pectinase）、幾丁質(zhì)酶（chitinase）、蛋白酶（protease）、脫落酸（abscisic acid）、毒素（toxin）等多種致病因子感染宿主（陶嵐，2016）。在不適合繁殖的環(huán)境中，灰葡萄孢菌會以菌核、菌絲體或分生孢子的形式形成休眠體寄生于宿主中。在合適的條件下，萌生的菌絲會爆發(fā)，通過分生孢子借自然氣候或人類生產(chǎn)活動進(jìn)行傳播（馬晨 等，2018）。Benito 等（1998）在20 ℃使用人工噴霧的方式將灰葡萄孢菌接種于番茄葉片，并進(jìn)行了詳細(xì)觀察，發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌感染番茄葉片分為3 個階段：導(dǎo)致宿主病殘?bào)w壞死病斑形成（20 h）、休眠階段（20～72 h）和最初壞死病斑的擴(kuò)散（72 h 以上）。然而，灰葡萄孢菌在 4 ℃時感染番茄葉片的過程緩慢而穩(wěn)定，番茄葉片無壞死現(xiàn)象（張智 等，2005）。

2 灰葡萄孢菌的化學(xué)防治

常用化學(xué)殺菌劑包括苯并咪哇類（benzodime）、N-苯基氨基甲酸酯類（benzodime）和苯胺基嘧啶類（anilinopyrimidine）等（王凌宇 等，2015）。由于灰葡萄孢菌具有快速繁殖、易基因突變、高適應(yīng)性的特點(diǎn)，這些特點(diǎn)極大地增加了遺傳變異的可能性。因此，灰葡萄孢菌易對常用的化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。

2.1 苯并咪哇類殺菌劑

最具代表性的苯并咪哇類殺菌劑包括：甲基硫菌靈、苯菌靈、苯硫脲，化學(xué)式如圖1-A 所示。它們的作用機(jī)制是抑制灰葡萄孢菌菌絲的伸長和孢子的分離，使微管蛋白和其他晶格結(jié)構(gòu)的形成受阻，從而摧毀細(xì)胞的有絲分裂和必需蛋白的生成，進(jìn)而表現(xiàn)出殺菌活性。

圖1 常用化學(xué)殺菌劑的化學(xué)式

A，苯并咪哇化合物；B，N-苯基氨基甲酸酯化合物；C，苯胺基嘧啶化合物。

2.2 N-苯基氨基甲酸酯類殺菌劑

代表性的化合物為乙霉威，化學(xué)式如圖1-B所示。作用機(jī)制是干擾灰葡萄孢菌菌核功能，并影響細(xì)胞膜和細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)，從而影響膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，從而殺死致病菌株。

2.3 苯胺基嘧啶類殺菌劑

代表性化合物是嘧霉胺，化學(xué)式如圖1-C 所示。其作用機(jī)制是抑制灰葡萄孢菌的胞外蛋白酶的分泌，減少病菌侵入位點(diǎn)寄主細(xì)胞的死亡。

2.4 穩(wěn)定性二氧化氯（ClO2）

穩(wěn)定性ClO2是世界上公認(rèn)的最佳殺菌劑之一，具有高性能和優(yōu)良控制效果。1996 年，我國質(zhì)檢相關(guān)部門將穩(wěn)定性ClO2添加到食品添加劑行列，使穩(wěn)定性ClO2在果蔬保鮮和海產(chǎn)品深加工中得以使用（GB 2760—1996）（鄭慶偉，2018）。穩(wěn)定性ClO2作為化學(xué)保鮮劑，在殺菌過程中不會發(fā)生氯的取代反應(yīng)，不會產(chǎn)生致癌、致畸的有機(jī)氯代產(chǎn)物（集賢 等，2017），因此它可以作為綠色果蔬、海產(chǎn)品保鮮技術(shù)的潛在資源。穩(wěn)定性ClO2也可作為采摘后果蔬抗灰葡萄孢菌的有效化合物（傅茂潤，2005）。它的作用機(jī)制是能夠有效地抑制采摘后果蔬灰葡萄孢菌過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和L-苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammo-nialyase，PAL）等防御酶活性的提高，使其對灰霉病的抗性增強(qiáng)，達(dá)到抑制病菌活性的效果。因此，無論對于離體還是活體有傷接種的采后果蔬，適宜濃度的穩(wěn)定性ClO2均具有較好的灰葡萄孢菌抑菌活性和防病效果。

2.5 新型化學(xué)試劑

由于灰葡萄孢菌對常用化學(xué)殺菌劑易產(chǎn)生抗性，為解決這一問題，多種新型的化學(xué)試劑如吡咯（pyrrole）、啶酰菌胺（boscalid）、嘧菌環(huán)胺（azoxystrobin）、氟噻唑吡乙酮（f luthiazolone）、環(huán)酰菌胺（fenhexamid）等被發(fā)掘利用。

吡咯殺菌劑中的咯菌腈（f lammonitrile）的主要?dú)⒕鷻C(jī)制是作用于滲透調(diào)節(jié)的信號傳遞途徑，因此防御效果較好。研究顯示，咯菌腈對灰葡萄孢菌的殺菌機(jī)制和抑菌機(jī)制有很大區(qū)別，殺菌機(jī)制主要是干擾并破壞其中心代謝通路的氧化途徑和菌體所需主要蛋白質(zhì)的生物合成過程，溶解病原菌的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞膜上的疏水鍵，破壞核酸與蛋白質(zhì)的合成，并氧化生命活動的主要蛋白質(zhì)（楊玉柱和焦必寧，2007）；而抑菌機(jī)制則是通過減弱與葡萄糖磷酸?；嘘P(guān)蛋白質(zhì)的傳遞來抑制病原菌菌絲的生長，最終導(dǎo)致病原菌的終結(jié)（張亞 等，2018）。

啶酰菌胺是一種通過抑制線粒體呼吸電子傳遞鏈上的傳遞載體-琥珀酸Q 還原酶活性來抑制線粒體呼吸的化合物，達(dá)到阻止病原菌菌絲生長的作用，其作用機(jī)理與其他酰胺類和苯甲酰胺類化合物類似。嘧菌環(huán)胺防治灰葡萄孢菌的作用機(jī)理是抑制真菌酯酶（esterase）、肽酶（peptidase）、核酸酶（nuclease）等水解酶的分泌和必需氨基酸甲硫氨酸的生物合成（王智 等，2016）。國外生產(chǎn)上經(jīng)常將啶酰菌胺與嘧菌環(huán)胺二者聯(lián)合使用。

氟噻唑吡乙酮是一種對卵菌綱病害表現(xiàn)出卓越防效的化學(xué)殺菌劑，通過對氧化固醇結(jié)合蛋白（oxysterol binding protein，OSBP）的抑制，阻止其穿梭細(xì)胞膜，從而達(dá)到殺菌效果。氟噻唑吡乙酮對灰葡萄孢菌具有預(yù)防、治療和抑制產(chǎn)孢作用，且藥效穩(wěn)定、耐雨水沖刷、可快速被植物蠟質(zhì)層吸收。施藥時用量少，葉面噴霧和種子處理均可。對用戶、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者和環(huán)境的安全性高（劉瑞賓 等，2018）；具有廣譜性和內(nèi)吸性，可以更好地控制灰葡萄孢菌（楊子輝 等，2017），其防效優(yōu)于目前生產(chǎn)上推廣使用的多種常規(guī)殺菌劑。德國拜耳公司開發(fā)出了一種新型的酰胺類殺菌劑—環(huán)酰菌胺，具有內(nèi)吸性和保護(hù)性。研究表明，環(huán)酰菌胺具有獨(dú)特的抗灰葡萄孢菌的作用機(jī)制，并且它與現(xiàn)有化學(xué)殺菌劑苯并咪唑、N-苯基氨基甲酸酯、苯胺嘧啶等無交叉抗性（輝勝，2018），結(jié)合熱力煙霧器防治，可以增加環(huán)酰菌胺在植物葉片上的沉積量，提高對溫室植物灰葡萄孢菌的防治效果（王學(xué)貴 等，2016）。

3 灰葡萄孢菌的生物防治

3.1 拮抗菌防治手段及作用機(jī)理

3.1.1 真菌防治 真菌是灰葡萄孢菌拮抗菌的主要菌群。1957 年，Newhook 在番茄植株上均勻噴灑芽枝霉（Cladosporium）孢子發(fā)酵液，以減少番茄果實(shí)中灰霉病的發(fā)生，是世界上早期使用真菌來防治灰葡萄孢菌的例子（Tronsmo & Dennis，1977）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有20 多種拮抗真菌可以用來防治灰霉病，其中木霉屬和酵母菌屬為主要研究對象。木霉屬中對灰葡萄孢菌具有拮抗作用的菌株主要包括哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、鉤狀木霉（T.hamatum）、擬康氏木霉（T. pseudoningii）以及綠色木霉（T. viride）等。木霉對灰葡萄孢菌的防控機(jī)制是利用細(xì)胞壁降解酶，如胞外纖維素酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶使灰葡萄孢菌細(xì)胞壁的主要成分纖維素、果膠、幾丁質(zhì)等物質(zhì)分解，引起灰葡萄孢菌細(xì)胞壁的降解和菌絲崩解，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)生理代謝遭到破壞（徐文 等，2017）。1977 年，Tronsmo 和Dennis首次發(fā)現(xiàn)哈茨木霉（T. harzianum）對草莓灰葡萄孢菌具有良好的防治效果（Tronsmo & Dennis，1977）。 研 究 發(fā) 現(xiàn)， 每667 m2施 用100～150 g 3×108CFU · g-1哈茨木霉菌（T. harzianum）可濕性粉劑，對草莓灰葡萄孢菌的防治效果可達(dá)75%左右（張富榮 等，2018）。

拮抗酵母菌主要用于植物采摘后灰葡萄孢菌的生物防治。作用機(jī)理為：與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)或生存空間，或?qū)Σ≡a(chǎn)生直接寄生作用，也可以誘導(dǎo)宿主自身抗病性。Redmond 等（1987）用黑色酵母菌（Exophiala jeanselmei）和淺白隱球酵母菌（Cryptococcus albidus）防治灰葡萄孢菌，其中黑色酵母菌對灰葡萄孢菌的防治效果達(dá)到63%，與殺菌劑撲海因（74%）的防治效果雖然有一定差距，但也足可見其具有良好的防治前景。王傲雪等（2018）研究了生防酵母菌對番茄離體果實(shí)灰葡萄孢菌的防治效果，結(jié)果表明，3 株生防酵母菌均可抑制番茄灰葡萄孢菌的繁殖，其中生防酵母菌（C.albidus 64）防治效果最佳，單一菌液處理的防治效果高達(dá)95.83%；當(dāng)番茄離體果實(shí)同時接種生防酵母菌和灰葡萄孢菌，防治效果達(dá)69.57%。

3.1.2 細(xì)菌防治 目前，有10 多種細(xì)菌應(yīng)用于灰葡萄孢菌的防治和研究。主要包括芽孢桿菌（Bacillus spp.）、假 單 胞菌（Pseudomonas spp.）、歐文氏菌（Erwinia spp.）和格式沙雷菌（Serratia spp.）等。其生防作用機(jī)理與真菌相似，通過抑制灰葡萄孢菌果膠酶活性，并誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生抗生素以及對灰葡萄孢菌產(chǎn)生營養(yǎng)競爭從而抑制其生長。馮玉龍等（1999）在草莓根部土壤里分離出22 株芽孢桿菌，對草莓灰葡萄孢菌有著不同程度的拮抗作用，這也表明灰葡萄孢菌具有豐富的拮抗菌資源。童蘊(yùn)慧等（2001）分離獲得對番茄灰葡萄孢菌有抑制作用的拮抗菌58 株，大部分拮抗細(xì)菌為芽孢桿菌，在溫室中的防效達(dá)76.6%～85.3%。李華（2005）篩選出的低溫海洋芽孢桿菌，對灰葡萄孢菌的最低抑菌濃度為4 μL · mL-1，在該濃度下對灰葡萄孢菌的生物防治效果為85.1%。陸繼臣等（2013）從蔬菜根際土壤中篩選出格氏沙雷菌（Serratia spp.），能顯著抑制灰葡萄孢菌分生孢子的萌發(fā)，抑制率達(dá)99%。王曉輝等（2015）從大連大黑山林間土壤中篩選出解淀粉芽孢桿菌 K1（Bacillus amyloliquefaciens K1），對灰葡萄孢菌有穩(wěn)定的抑制作用，抑菌圈直徑達(dá)到45 mm。然而，解淀粉芽孢桿菌K1 的抑菌機(jī)制較復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。羅琳等（2017）從紅棗中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌T2，在植物葉片離體和活體試驗(yàn)中均對灰葡萄孢菌具有良好的防治效果，并具有廣譜抗性，經(jīng)16S rDNA 鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。馬超等（2018）以從植物中分離的內(nèi)生細(xì)菌為材料，篩選出對番茄灰葡萄孢菌等有拮抗作用的菌株解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，發(fā)酵液對番茄灰葡萄孢菌的抑制率分別達(dá)到86.6%和83.0%，且2 個菌株對黃瓜灰霉病菌等9種病原菌也有較高的拮抗活性。

3.2 天然產(chǎn)物防治

早在2004 年，何培青便發(fā)現(xiàn)植物揮發(fā)性物質(zhì)如脂肪酸衍生物、單萜和倍半萜化合物以及芳香族化合物具有抑制植物灰霉病的作用，番茄葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)對灰葡萄孢菌孢子的萌發(fā)抑制率為34.5%，對菌絲生長的抑制率為75.2%，抑制灰葡萄孢菌的效率依次為脂肪酸衍生物＞芳香族化合物＞萜類化合物（何培青，2005）。劉樹芳等（2006）利用268 種放線菌次生代謝產(chǎn)物作為篩選對象，發(fā)現(xiàn)其中16 種對百合灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制率可達(dá)80%，10 種對黃瓜離體葉片的灰葡萄孢菌防治效果可達(dá)到50%。王帥宇等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，用20% β-羽扇豆球蛋白多肽可溶液劑 0.93 g · L-1和0.67 g · L-1兩種濃度噴霧植物葉片后，田間對灰霉病的防治效果分別為82.71%、56.20%，顯著高于對照50%腐霉利可濕性粉劑，且持效性存在顯著優(yōu)勢，但速效性則處于劣勢。李瑞環(huán)等（2012）研究證實(shí)，4.5%丙 · 殼寡糖可溶性藥劑（丙烷脒4%+殼寡糖0.5%）對灰葡萄孢菌具有抑制效果，常規(guī)噴霧方法可用于控制植物果蔬的灰霉病。鄒陳文翔（2016）對鏈霉菌SN-194 的次級代謝產(chǎn)物—二蔭類化合物進(jìn)行提取純化，對灰葡萄孢菌的抑制率為24.73%～80.08%。王曉瑩（2016）發(fā)現(xiàn)殼聚糖寡糖抑制了草莓灰葡萄孢菌菌絲的生長及其孢子萌發(fā)，用殼聚糖寡糖溶液處理新鮮草莓果實(shí)，隨著溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，對灰葡萄孢菌的抑制作用增強(qiáng)。俞晗（2017）研究發(fā)現(xiàn)致病桿菌（Xenorhabdus bovienii）SN 84 菌株發(fā)酵液產(chǎn)物濃度為2%時，對番茄灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制率近50%，當(dāng)濃度為8%時，抑制效果最佳。

4 化學(xué)防治與生物防治的比較

4.1 化學(xué)防治的優(yōu)缺點(diǎn)

目前，農(nóng)業(yè)領(lǐng)域灰葡萄孢菌的主要防治措施仍然是施用化學(xué)殺菌劑。防治成本低、防治效果快、效率高，能迅速有效地控制病蟲害的蔓延。這是生物防治方法難以達(dá)到的。其使用方法簡便，既可以利用藥械施藥，也可以用各種人工土法土械來施藥。化學(xué)殺菌劑品種繁多，不同品種的農(nóng)藥可以混合使用，以達(dá)到兼治的目的，能夠減輕勞動強(qiáng)度，節(jié)省成本。但化學(xué)殺菌劑施用不當(dāng)會造成安全隱患和經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重時會破壞原生物群落結(jié)構(gòu)，打破農(nóng)業(yè)生態(tài)的自然穩(wěn)態(tài)平衡。

此外，長期使用化學(xué)殺菌劑會使病原菌產(chǎn)生抗藥性。盧曉雪等（2018）對長三角地區(qū)果蔬灰葡萄孢菌抗藥性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：灰葡萄孢菌菌株對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、咯菌腈、啶酰菌胺的抗性頻率分別達(dá) 68.57%、70.48%、68.10%、0.15%、23.00%。肖婷等（2018）采用區(qū)分計(jì)量法對江蘇省句容市灰葡萄孢菌對啶酰菌胺的抗藥性進(jìn)行研究，結(jié)果表明總抗性菌株占42.60%。杜穎（2018）從遼寧省8 個地區(qū)的番茄種植區(qū)中采集、分離純化得到番茄灰葡萄孢菌115 株，采用菌絲生長速率法測定其對腐霉利的抗藥性，結(jié)果表明抗性頻率達(dá)到83.48%?？梢?，灰葡萄孢菌極易產(chǎn)生抗藥性，因此灰葡萄孢菌化學(xué)防治的發(fā)展歷史一直以來是為解決病原菌抗藥性而不斷推陳出新的過程。

4.2 生物防治的優(yōu)缺點(diǎn)

生物防治是近年來新興起的熱門治理手段，雖然拮抗菌的報(bào)道很多，但真正應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的卻很少。最大的阻力是因?yàn)檗卓刮⑸镌诜乐位移咸焰呔矫娴淖饔檬艿蕉喾N因素的影響，其中最重要的是菌體所處的生態(tài)環(huán)境（呂婷，2018）。環(huán)境因素既可以影響拮抗菌活性的表現(xiàn)，又可以影響植物體表面拮抗菌的固定繁殖。相比較化學(xué)殺菌劑，拮抗微生物在使用時操作方法繁瑣，并且必須明確拮抗微生物使用的適宜濃度、時間和方法，使之統(tǒng)一并規(guī)范化，才可以保證田間防治效果的穩(wěn)定。而且與化學(xué)殺菌劑的廣泛性不同，拮抗菌具有專一性，一種拮抗菌只能對一種或一類病害微生物有拮抗效果（王曉輝 等，2015）。但生物防治的突出優(yōu)勢是它更符合綠色、循環(huán)利用和可持續(xù)的農(nóng)業(yè)發(fā)展趨勢，因?yàn)樯锓乐螌θ诵蟀踩珶o毒，無污染、不殘留、無添加。其次，拮抗微生物對病原菌具有很強(qiáng)的特異性，對天敵和有益生物負(fù)作用小，不會打破生態(tài)穩(wěn)態(tài)平衡。

5 展望

灰葡萄孢菌是一種世界范圍的植物病原菌。化學(xué)防治是目前控制其蔓延的主要手段之一，但隨著灰葡萄孢菌抗藥性的不斷增強(qiáng)，研究人員希望通過對灰葡萄孢菌抗性機(jī)制的研究，開發(fā)出新型復(fù)合殺菌劑來延緩菌株抗藥性的產(chǎn)生，延長藥劑使用壽命；合理評定使用時間和使用劑量以減少對生態(tài)平衡的破壞。Elad（1994）利用分離出的腐生性酵母菌紅酵母菌（Rhodotorula glutinis）和淺白隱球酵母菌（Cryptococcus al-bidus），對菜豆和番茄的灰葡萄孢菌進(jìn)行防治效果研究，顯示其在溫室內(nèi)具有較好的防治效果，已經(jīng)和哈茨木霉相當(dāng)。商業(yè)殺菌劑Trichodex 已經(jīng)在包括歐洲和北美在內(nèi)的20 多個國家注冊，推廣和應(yīng)用。以色列 Makhteshim-Agan公司研發(fā)的以哈氏木霉作為拮抗菌的商品化防腐劑已面世，可防治由灰葡萄孢菌引起的果蔬灰霉病?？梢灶A(yù)見，生物防治類灰葡萄孢菌防控制劑在國外的商業(yè)開發(fā)將會越來越多。隨著產(chǎn)品防效的不斷提高，將會具有巨大市場潛力，并取得較好的經(jīng)濟(jì)效益。