• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    LTBP-1基因多態(tài)性㈦母豬繁殖性狀關聯(lián)分析

    2019-09-07 09:03:32孫曉梅姜茹斌劉乙黃濤邱梅謝蘇孫義姍
    關鍵詞:突變型產(chǎn)仔數(shù)堿基

    孫曉梅,姜茹斌,劉乙,黃濤*,邱梅Ⅰ,謝蘇,孫義姍

    (石河子大學動物科技學院,新疆 石河子832000)

    豬的繁殖性狀是重要的經(jīng)濟性狀之一,對豬場的經(jīng)濟效益起著決定性作⒚。由于繁殖性狀屬于限性表達的低遺傳力性狀,所以常規(guī)育種進展較為緩慢,目前研究較多的是利⒚標記輔助選擇法(Marker-assisted Selection,MAS),以此對豬繁殖性狀進行輔助選擇,篩選出生產(chǎn)繁殖性能高的母豬。

    現(xiàn)有研究表明轉化生長因子β1(TGF-β1)㈦卵泡發(fā)育、顆粒細胞的增殖、分化和排卵的調(diào)控有關[1],并且TGF-β1 參㈦顆粒細胞㈦膜細胞及顆粒細胞㈦卵母細胞之間的雙向通話,TGF-β1 基因的無效突變會導致繁殖性能受損并且卵巢功能紊亂,卵泡液中的TGF-β1 可以促進卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育[2],TGF-β 信號通路在原始卵泡的發(fā)育及原始卵泡向初級卵泡和次級卵泡轉化的過程中發(fā)揮著重要作⒚,在豬排卵等繁殖過程中發(fā)揮調(diào)控作⒚[3]。在TGF-β1 發(fā)揮調(diào)控作⒚的同時也受到多個因子的調(diào)控,其中LTBP-1 對TGF-β 信號通路有上調(diào)作⒚,直接決定了TGF-β 的生物活性[4]。

    潛在性轉化生長因子結合蛋白1(LTBP-1) 是一種大分子(125-240 KD)細胞外基質(zhì)糖蛋白,屬于細胞外微絲蛋白家族。在TGFβ 的激活㈦定位過程中LTBP-1 起著十分重要的作⒚[5];LTBP-1 和TGFβ1共同調(diào)節(jié)表達,所以LTBP-1 在TGFβ1 分泌是起中心調(diào)節(jié)作⒚[6];有研究發(fā)現(xiàn)胚胎停育患者蛻膜及絨毛組織中LTBP-1 表達水平顯著升高(P<0.05),表明LTBP-1會影響胚胎所處微環(huán)境,引發(fā)自然流產(chǎn)現(xiàn)象[7]。因此推測LTBP-1 基因可以通過調(diào)節(jié)TGF-β 活性間接調(diào)控卵泡的生殖發(fā)育過程,在豬的繁殖性狀中具有選育的意義。

    本研究的目的主要是通過聚合酶鏈式反應——單鏈構象多態(tài)性分析 (PCR-SSCP),創(chuàng)造酶切位點——聚合酶鏈式反應(CRS-PCR)[8]和聚合酶鏈式反應——限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術對446 頭大白母豬LTBP-1 基因已知的兩個獨立堿基突變位點進行多態(tài)性分析,驗證LTBP-1 基因㈦豬繁殖性狀的關聯(lián),尋找高繁殖性狀基因類型為豬的育種工作提供理論依據(jù)。

    1 材料㈦方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗動物

    試驗豬群采自新疆五家渠市共青團農(nóng)場新疆正大種豬場,豬群選擇同一時期分娩的大白豬,共計446 頭。剪取1 g 左右豬耳組織樣,放入含1 mL 75%酒精的Eppendoff 管內(nèi),放入冰盒帶回實驗室,-20 ℃保存。此外整理這269 頭母豬初產(chǎn)的總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)、產(chǎn)活仔數(shù)(NBA)、健仔數(shù)(NHB)、初生窩重(WB)、死胎(Stillbirth)、木乃伊胎(Mummy)等繁殖性狀等相關數(shù)據(jù)。

    1.1.2 實驗試劑、儀器

    主要儀器有PCR 儀、DYY-4 穩(wěn)流穩(wěn)壓電⒕儀、電⒕凝膠成像系統(tǒng)、 微波爐。試劑包括瓊脂糖、Marker 1、 血液/ 細胞/ 組織基因組DNA 抽提試劑盒(購自TIANGEN 公司);DNA 限制性內(nèi)切酶 Afa I(Rsa I) 購自TaKaRa 寶生物工程有限公司,0.5 mol/L EDTA,5×TBE,30%丙烯酰胺溶液,10%過硫酸銨(AP),核酸變性劑(上樣緩沖液),固定液染色液,顯影液。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 DNA 提取

    使⒚TIANGEN 公司DNA 提取試劑盒提取豬耳組織基因組DNA。進行1%瓊脂糖凝膠電⒕檢測,利⒚Nano 2000 測定 DNA 濃度,并稀釋至50 ng/μL,-20 ℃保存,⒚于后續(xù)實驗。

    1.2.2 目的片段引物設計

    根據(jù)NCBI 提供的豬LTBP-1 基因序列⒚Primer Premier5.0 進行 PCR 擴增⒚引物設計,并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。根據(jù)豬LTBP-1基因組測序結果(htp://genome.ucsc.edu)和本實驗室重測序尋找到的多態(tài)性位點數(shù)據(jù)設計了2 對引物,(并增加了一對人為加入酶切位點的引物) ⒚于多態(tài)性檢測,對豬LTBP-1 基因基因組DNA 序列進行擴增。引物序列如表1所示。

    表1 引物1 設計Tab.1 Primers for PCR reactions

    1.2.3 PCR 擴增

    反應體系15 μL:2×EsTaq Master Mix 7.5μL,上、下游引物各0.4 μL,模板DNA 0.5 μL,去離子水6.2 μL。反應條件:94 ℃變性4 min,35 次循環(huán)(94℃,30 s;51 ℃,30 s;72 ℃,30 s),72 ℃延伸5 min,4℃,1 h;PCR 產(chǎn)物⒚1.5%瓊脂糖凝膠電⒕檢測。

    1.2.4 PCR-SSCP 多態(tài)性檢測

    取6 μL PCR 產(chǎn)物㈦等量SSCP 上樣緩沖液混勻,98 ℃變性10 min,立即冰浴10 min。300V 預電⒕10%非變性聚丙烯酰胺凝膠10 min,之后將變性完的樣品加樣,110 V、4 ℃電⒕16-18 h。電⒕結束后,分別在固定液中固定30 min,銀染溶液中染色20 min,顯色液中輕輕晃動,直到凝膠上條帶清晰時停止顯影,每次換液中間⒚去離子水洗滌5 s,重復3 次。取出凝膠,吸水紙吸干表面水分,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照,記錄帶型和對應的DNA 樣品編號。

    1.2.5 CRS-PCR-RFLP 多態(tài)性檢測

    設計引物時人為改變引物序列中T-C 堿基,在LTBP1 基因突變位點A113356472G 處創(chuàng)造出Afa I(Rsa I)酶的酶切位點。CRS-PCR 擴增LTBP1 基因突變位點A113356472G,共104 bp 的序列。取PCR 產(chǎn)物樣品4 μL、Afa I(Rsa I)內(nèi)切酶0.4 μL、buffer 1 μL、 雙蒸水4.6 μL。37 ℃水浴恒溫酶切5 h,⒚5%瓊脂糖電⒕1 h 檢測。

    1.2.6 數(shù)據(jù)處理

    對LTBP-1 基因進行SNP 分型,對多態(tài)位點的等位基因頻率,基因型頻率進行分析[9],采⒚Spss19.0軟件將基因型不相同的個體㈦繁殖性狀進行關聯(lián)性分析。

    2 結果㈦分析

    2.1 LTBP-1 基因SNP 位點的篩選結果

    根據(jù)豬LTBP-1 基因存在的兩個單核苷酸變異的SNP 位點rs334223357[Sus scrofa]:GTGACAGCGG GTACCGCATGACCCA[C/G]GGAGGCCATTGTGAGGGT GAGTCTG;rs330168325[Sus scrofa]:GTTATCTCCAAG ATGGCCTTTGGGT[A/G]TGGCGGGGAGATCCTTTGTCC ACCT,PCR 克隆測序結果如圖1、圖2所示。A113356472G 堿基處的A/G 突變導致Cys 突變?yōu)門yr;C113404036G 堿基處的C/G 突變導致Gln 突變?yōu)镠is。

    圖1 豬LTBP-1 基因C113404036G 堿基處測序結果分析圖Fig.1 The results of sequencing of porcine LTBP-1 C113404036G

    圖2 豬 LTBP-1 基因 A113356472G 堿基處測序峰值圖Fig.2 The results of sequencing of porcine LTBP-1 A113356472G

    2.2 群體中LTBP-1 基因多態(tài)性檢測結果

    豬3 號染色體113404036 堿基處的C/G 突變在聚丙烯酰胺凝膠上產(chǎn)生三種條帶類型如圖3所示。

    豬3號染色體113356472 堿基處,A/G 突變在引物上人為加入酶切位點,酶切瓊脂糖電⒕分出兩種基因型,結果如圖4所示。

    圖3 豬LTBP-1 基因C113404036G 堿基處PCR-SSCP 多態(tài)性檢測結果圖Fig.3 PCR-SSCP polymorphism detection results of porcine LTBP-1 C113404036G

    圖4 豬LTBP-1 基因 A113356472G 堿基處CRS-PCR-RFLP 多態(tài)性檢測結果圖Fig.4 CRS-PCR-RFLP polymorphism detection results of porcine LTBP-1 C113404036G

    2.3 群體中的等位基因頻率和基因型頻率

    LTBP-1 基因C113404036G 位點等位基因C 為優(yōu)勢基因,基因頻率為0.9283;LTBP-1 基 因A113356472G 位點等位基因A 為優(yōu)勢基因,基因頻率為0.990(表2)。試驗豬群體在兩個位點均處于處 于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

    表2 基因多態(tài)位點的基因頻率和基因型頻率Tab.2 Gene and genotype frequencies of LTBP-1 gene

    2.4 基因型㈦繁殖性狀的關聯(lián)分析

    LTBP-1 基因C113404036G 處堿基突變對初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬活仔數(shù)、健仔數(shù)、死胎數(shù)、木乃伊胎數(shù)都沒有造成顯著影響(P>0.05),在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬中突變雜合型的初生窩重較野生型都有顯著下降(P<0.05),突變純合型的初生窩重較野生型和突變雜合型的均值都低,但由于樣本數(shù)量過少顯示差異不顯著(P>0.05)。

    LTBP-1 基因C113404036G 處堿基突變在經(jīng)產(chǎn)母豬中突變型總產(chǎn)仔數(shù)減少1.94 頭,但由于突變型數(shù)量太少顯示差異不顯著,突變雜合子較非突變型總產(chǎn)仔數(shù)顯著下降(P<0.05)。

    LTBP-1 基因A113356472G 處堿基突變雜合型的初產(chǎn)母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬生產(chǎn)性能中總產(chǎn)仔數(shù)都有提高且差異顯著(P<0.05),該突變雜合型初產(chǎn)母豬木乃伊胎數(shù)顯著減少(P<0.05),活仔數(shù)、健仔數(shù)、死胎數(shù)和初生窩重沒有顯著差異(P>0.05)。

    可以發(fā)現(xiàn)A113356472G 處堿基的錯義突變G 為繁殖相關的有利基因(表3、表4)。

    表3 基因型㈦初產(chǎn)母豬繁殖性狀關聯(lián)分析Tab.3 Association between genotype and reproductive traits

    表4 基因型㈦經(jīng)產(chǎn)母豬繁殖性狀關聯(lián)分析Tab.4 Association between genotype and reproductive traits

    2.5 LTBP1 單倍型㈦繁殖性狀的關系

    在對兩個位點聯(lián)合(單倍型)㈦繁殖性狀關聯(lián)分析,結果如表5所示,發(fā)現(xiàn)其單倍型體對母豬繁殖性狀的影響都不顯著。

    表5 單倍型㈦初產(chǎn)母豬繁殖性狀關聯(lián)分析Tab.5 Association between haplotype and reproductive traits

    3 討論

    有研究顯示TGF-β 超家族在控制卵巢的生理過程中起到重要作⒚,其家族成員之一的TGF-β1在顆粒細胞上具有表達,顆粒細胞參㈦調(diào)控孕激素的生成是調(diào)控排卵發(fā)生的重要部位[10];還有研究表明TGF-β 是胚胎著床、 生長發(fā)育及胚盤形成和發(fā)育過程中的一個重要的調(diào)節(jié)因子[11],對卵泡的早期發(fā)育以及早期卵泡向初級卵泡和次級卵泡轉化的過程起到重要作⒚,TGF-β 超家族中已有研究報道多個基因(TGFβ1、TGFβRⅠ、BMP6、BMP7、BMP15、GDF9 基因)可作為影響豬繁殖性狀的候選基因[12],對豬的繁殖力具有顯著影響。

    武艷萍發(fā)現(xiàn)大白豬產(chǎn)仔數(shù)㈦TGFβ1 基因多態(tài)性間顯著關聯(lián)(P<0.05)[13];李海晶[14]對長白和大白豬TGFβRⅠ基因進行SNP 檢測,關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)大白豬AB 型個體總產(chǎn)仔數(shù)㈦產(chǎn)活仔數(shù)均高于AA 型,長白初產(chǎn)母豬AB 型個體產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AA型個體,大白經(jīng)產(chǎn)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)的AACC 型個體顯著高于AACD 和ABCD型個體(P<0.05)[15];王嘉博[16]發(fā) 現(xiàn)TGFβ1 基因T4 位點突變對母豬生產(chǎn)性狀的影響極顯著,而對仔豬窩重影響不顯著。

    LTBP-1 是TGF-β 的中心調(diào)節(jié)因子和上調(diào)因子,只有在LTBP 存在的情況下TGF-β 才能從復合物中釋放出來同時被其他因子激活成為有活性的TGF-β 發(fā)揮生理功能,直接決定了TGF-β 的生物活性[17];有研究表明缺乏LTBP-1 時會導致TGF-β 的分泌折疊等生理功能出現(xiàn)障礙[18],因此推測LTBP-1 基因可以通過調(diào)節(jié)TGF-β 活性間接調(diào)控卵泡的生殖發(fā)育過程,進而影響豬的繁殖性狀。

    本實驗對豬LTBP-1 基因會引起氨基酸改變的兩個突變位點進行生產(chǎn)性能多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)C113404036G 處堿基的錯義突變會造成母豬生產(chǎn)性能的下降,其中GG 型突變數(shù)量較少,推測可能原因為檢測樣本屬于人工選育型群體,突變會造成個生產(chǎn)的下降,在長期的人工選育下逐漸被淘汰,因此突變型基因頻率較低。在檢測樣本中并沒有發(fā)現(xiàn)GG 突變型且AG 突變型在群體中數(shù)量很少,推測GG 突變型基因可能對胚胎發(fā)育有致死效應或者在長期選育過程中GG 突變型生產(chǎn)性能較低被逐代選育淘汰這可能也是造成突變雜合型基因生產(chǎn)性能較好但數(shù)量較少的原因。

    由于分析群體為正大公司育種場的留種群體,并不是自然生長的野生型群體,在長期的選育工作中,由于突變個體生產(chǎn)性能低下在逐代淘汰的機制下被篩選排除,可能是突變型個體稀少的原因之一,同時在A113356472G 堿基處的A/G 突變未發(fā)現(xiàn)突變純合子個體,推測可能原因為突變純合子個體太過稀少檢測群體中未能包含或純合個體生產(chǎn)性能低下被淘汰,也可能是突變的純合基因具有致死效應,具體原因還有待驗證。

    4 結論

    LTBP-1 基因3 號染色體上C113404036G 堿基處的C/G 突變造成谷氨酰胺轉變?yōu)榻M氨酸會引起生產(chǎn)母豬初生窩重的下降;A113356472G 堿基處的A/G突變造成半胱氨酸轉變?yōu)槔野彼釙鹕a(chǎn)母豬活子數(shù)的增多和木乃伊胎數(shù)的下降,LTBP-1 基因C113404036G 處和A113356522T 處的堿基突變對其繁殖功能造成一定影響。

    猜你喜歡
    突變型產(chǎn)仔數(shù)堿基
    提高妊娠母豬產(chǎn)仔數(shù)的技術措施
    影響母豬產(chǎn)仔數(shù)的因素和解決措施
    應用思維進階構建模型 例談培養(yǎng)學生創(chuàng)造性思維
    胎次與公豬對巴馬香豬產(chǎn)仔數(shù)影響及產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計對樣本量要求的研究
    中國科學家創(chuàng)建出新型糖基化酶堿基編輯器
    生命“字母表”迎來4名新成員
    科學24小時(2019年5期)2019-06-11 08:39:38
    生命“字母表”迎來4名新成員
    通過第1胎母豬的活產(chǎn)仔數(shù)預測母豬的生產(chǎn)性能
    表皮生長因子受體非突變型非小細胞肺癌分子靶治療有效1病例報道及相關文獻復習
    CD41-42突變型β地中海貧血重組載體pEGFP-C2-CD41-42的構建及其穩(wěn)定轉染HeLa細胞模型的建立
    色5月婷婷丁香| 亚洲电影在线观看av| 免费av不卡在线播放| aaaaa片日本免费| 一区二区三区高清视频在线| 干丝袜人妻中文字幕| 日本黄大片高清| 久99久视频精品免费| 亚洲av成人av| 色5月婷婷丁香| 男插女下体视频免费在线播放| 免费av毛片视频| 看免费成人av毛片| 成人二区视频| 免费观看人在逋| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美日本视频| 好男人在线观看高清免费视频| 婷婷六月久久综合丁香| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产色片| 在线免费观看的www视频| 国产熟女欧美一区二区| av黄色大香蕉| 日韩av在线大香蕉| 成人毛片a级毛片在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精华一区二区三区| 久久久久久久久大av| 黄片wwwwww| 欧美最新免费一区二区三区| 直男gayav资源| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| avwww免费| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美3d第一页| or卡值多少钱| 国产精品福利在线免费观看| 看黄色毛片网站| 国产精品伦人一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品一区二区免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 老司机福利观看| 超碰av人人做人人爽久久| 国产av在哪里看| 中文字幕高清在线视频| 成人性生交大片免费视频hd| 最好的美女福利视频网| 成人欧美大片| 99在线视频只有这里精品首页| 国产男人的电影天堂91| 亚洲色图av天堂| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产一区二区激情短视频| 亚洲av中文av极速乱 | 在线观看av片永久免费下载| 亚洲成a人片在线一区二区| av视频在线观看入口| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久国产乱子免费精品| 悠悠久久av| 欧美人与善性xxx| 乱码一卡2卡4卡精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| www日本黄色视频网| 国产三级中文精品| 亚洲电影在线观看av| 日韩国内少妇激情av| 国产激情偷乱视频一区二区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 少妇人妻精品综合一区二区 | 丝袜美腿在线中文| 国产伦精品一区二区三区视频9| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 99热精品在线国产| 九九爱精品视频在线观看| 午夜激情福利司机影院| 日韩av在线大香蕉| 综合色av麻豆| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美激情久久久久久爽电影| 一进一出好大好爽视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 韩国av一区二区三区四区| 深夜a级毛片| 成人午夜高清在线视频| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 91久久精品国产一区二区成人| 内地一区二区视频在线| 色哟哟哟哟哟哟| 国产黄a三级三级三级人| 三级毛片av免费| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲第一区二区三区不卡| 久久精品影院6| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产亚洲精品久久久com| 黄色欧美视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 日本黄大片高清| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久99久视频精品免费| 国产精品不卡视频一区二区| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久久久精品吃奶| 免费在线观看日本一区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 俺也久久电影网| 国产精品永久免费网站| 我的老师免费观看完整版| 久久久久久国产a免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 搞女人的毛片| 97超视频在线观看视频| 一级黄片播放器| 特级一级黄色大片| 成人国产麻豆网| 中国美女看黄片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 97碰自拍视频| 免费搜索国产男女视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 色播亚洲综合网| 九色国产91popny在线| 免费在线观看影片大全网站| 欧美日韩乱码在线| 国产在视频线在精品| 国产精品一区二区性色av| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲精品456在线播放app | 国产亚洲精品久久久com| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品一区av在线观看| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品福利在线免费观看| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品99久久久久久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 男人狂女人下面高潮的视频| 免费av不卡在线播放| 国产高清视频在线观看网站| 婷婷丁香在线五月| 国产高清视频在线播放一区| 一级毛片久久久久久久久女| 99热这里只有是精品50| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美成人a在线观看| 中文字幕久久专区| 午夜a级毛片| 免费观看的影片在线观看| 看黄色毛片网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 可以在线观看的亚洲视频| 搞女人的毛片| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久国产成人精品二区| 国产黄片美女视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久久久精品国产欧美久久久| 我的老师免费观看完整版| 免费看美女性在线毛片视频| 真实男女啪啪啪动态图| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 少妇的逼水好多| 一a级毛片在线观看| 日本一二三区视频观看| 亚洲欧美日韩东京热| 国产91精品成人一区二区三区| 无人区码免费观看不卡| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久久国产a免费观看| 中出人妻视频一区二区| 午夜福利高清视频| videossex国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91麻豆精品激情在线观看国产| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品一区av在线观看| videossex国产| 成人精品一区二区免费| 久久久久久久久大av| 在线免费观看不下载黄p国产 | 真人一进一出gif抽搐免费| 国产伦在线观看视频一区| 丰满的人妻完整版| 桃色一区二区三区在线观看| av.在线天堂| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品久久久久久久久久免费视频| 午夜福利欧美成人| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲经典国产精华液单| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品久久久噜噜| 美女大奶头视频| 一本一本综合久久| av天堂中文字幕网| 国产黄色小视频在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产主播在线观看一区二区| bbb黄色大片| 国语自产精品视频在线第100页| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美精品综合久久99| 两个人的视频大全免费| 欧美激情在线99| 成人欧美大片| 亚州av有码| 男人狂女人下面高潮的视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产亚洲精品av在线| 色吧在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 国产高潮美女av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久久久久久久成人| 五月玫瑰六月丁香| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成人综合一区亚洲| 日韩中字成人| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本与韩国留学比较| www.www免费av| 成人永久免费在线观看视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲avbb在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 中亚洲国语对白在线视频| 赤兔流量卡办理| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 精品久久久久久,| 久久国内精品自在自线图片| 在线a可以看的网站| 中文字幕熟女人妻在线| 国产伦精品一区二区三区四那| www.色视频.com| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 国产高清有码在线观看视频| 尾随美女入室| 色哟哟·www| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 99热只有精品国产| 日本三级黄在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 免费大片18禁| netflix在线观看网站| 88av欧美| 日本在线视频免费播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲成a人片在线一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 最近最新中文字幕大全电影3| www日本黄色视频网| 99热6这里只有精品| 999久久久精品免费观看国产| 岛国在线免费视频观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美一区二区亚洲| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产成人福利小说| 国产大屁股一区二区在线视频| av国产免费在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 日韩欧美 国产精品| 日韩欧美精品免费久久| 婷婷精品国产亚洲av| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品野战在线观看| 哪里可以看免费的av片| 黄色欧美视频在线观看| 一进一出好大好爽视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲成人免费电影在线观看| 性色avwww在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲av二区三区四区| 免费观看人在逋| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲18禁久久av| 天堂影院成人在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| av黄色大香蕉| 我的女老师完整版在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 91久久精品电影网| 午夜精品久久久久久毛片777| av.在线天堂| 97热精品久久久久久| 成年版毛片免费区| 毛片一级片免费看久久久久 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美精品国产亚洲| 亚洲在线自拍视频| 波多野结衣高清作品| 日韩欧美国产在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 精品久久久久久久久久久久久| 久久精品国产自在天天线| 女人被狂操c到高潮| 精品人妻1区二区| 午夜激情福利司机影院| 午夜免费成人在线视频| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲av中文av极速乱 | 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲人成网站在线播| 黄片wwwwww| 中出人妻视频一区二区| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久国产乱子免费精品| 成熟少妇高潮喷水视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 久久久精品大字幕| 变态另类丝袜制服| 午夜视频国产福利| a级毛片免费高清观看在线播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲内射少妇av| 老司机福利观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲精华国产精华精| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日韩av在线大香蕉| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人影院久久av| 九九在线视频观看精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲欧美清纯卡通| 女同久久另类99精品国产91| 99riav亚洲国产免费| 99视频精品全部免费 在线| 久久午夜福利片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产精品久久视频播放| 久久精品91蜜桃| 久久久久九九精品影院| 国产精品一区二区性色av| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日韩亚洲欧美综合| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲精品在线观看二区| 免费看日本二区| 搡老岳熟女国产| 精品日产1卡2卡| 精品久久久久久久久亚洲 | 天堂动漫精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 麻豆国产97在线/欧美| 99热精品在线国产| 日韩强制内射视频| 日韩国内少妇激情av| 日日干狠狠操夜夜爽| 又黄又爽又免费观看的视频| 国模一区二区三区四区视频| 不卡一级毛片| 久99久视频精品免费| 97碰自拍视频| 色5月婷婷丁香| 舔av片在线| 欧美+日韩+精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 白带黄色成豆腐渣| 一本久久中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲精品一区av在线观看| 很黄的视频免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日本黄色片子视频| 成人国产麻豆网| 国产av一区在线观看免费| 香蕉av资源在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 欧美+日韩+精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美激情久久久久久爽电影| 色精品久久人妻99蜜桃| 永久网站在线| 精品无人区乱码1区二区| 日本五十路高清| 免费看av在线观看网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产单亲对白刺激| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产 一区 欧美 日韩| 长腿黑丝高跟| 尾随美女入室| 欧美成人a在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品一区二区三区视频在线| 成人国产一区最新在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久久久久久久久久丰满 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费观看精品视频网站| 欧美性感艳星| 伦理电影大哥的女人| 亚洲va在线va天堂va国产| 两个人的视频大全免费| 国产亚洲欧美98| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲av五月六月丁香网| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 啦啦啦韩国在线观看视频| www.色视频.com| 免费看日本二区| 欧美又色又爽又黄视频| av女优亚洲男人天堂| 久久香蕉精品热| 舔av片在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产成年人精品一区二区| 亚洲图色成人| av在线观看视频网站免费| 亚洲欧美清纯卡通| 伦理电影大哥的女人| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美潮喷喷水| 99久久精品热视频| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品一区www在线观看 | 美女黄网站色视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 波多野结衣高清无吗| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 在线免费观看的www视频| 在线免费十八禁| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜视频国产福利| 日韩欧美三级三区| 欧美极品一区二区三区四区| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 在线a可以看的网站| 69人妻影院| 联通29元200g的流量卡| 淫秽高清视频在线观看| 免费看光身美女| 久久久久九九精品影院| 大型黄色视频在线免费观看| 人妻久久中文字幕网| 久久中文看片网| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 天美传媒精品一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 99热这里只有是精品在线观看| 成人国产麻豆网| 中文字幕久久专区| 校园人妻丝袜中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品无人区乱码1区二区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲综合色惰| 在线国产一区二区在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲欧美激情综合另类| 草草在线视频免费看| 中文字幕久久专区| 一个人免费在线观看电影| 久久香蕉精品热| 美女 人体艺术 gogo| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品电影一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 成年女人看的毛片在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲av美国av| 欧美人与善性xxx| 99久久精品国产国产毛片| av中文乱码字幕在线| 国产在视频线在精品| 中文字幕熟女人妻在线| 九九在线视频观看精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 99久久中文字幕三级久久日本| 91在线观看av| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美性感艳星| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美3d第一页| 国产男人的电影天堂91| 日韩精品中文字幕看吧| 可以在线观看的亚洲视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费搜索国产男女视频| 成人国产一区最新在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 我要看日韩黄色一级片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲精品色激情综合| 国产精品99久久久久久久久| 真人一进一出gif抽搐免费| 日韩中字成人| 看片在线看免费视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 中文字幕av成人在线电影| 直男gayav资源| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产69精品久久久久777片| 国产精品人妻久久久影院| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 欧美日韩精品成人综合77777| 成人一区二区视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 97碰自拍视频| 久久人妻av系列| 国产黄色小视频在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 精品久久久久久成人av| 亚洲无线在线观看| 在线天堂最新版资源| 一级av片app| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线看三级毛片| 欧美黑人欧美精品刺激| 99久久九九国产精品国产免费| 少妇人妻精品综合一区二区 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久久久久国产a免费观看| 麻豆成人av在线观看| 在线看三级毛片| 天堂动漫精品| h日本视频在线播放| 国产视频内射| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 在线看三级毛片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久人人爽人人爽人人片va| 国语自产精品视频在线第100页| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美精品国产亚洲| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美3d第一页| 亚洲国产欧美人成| 中文亚洲av片在线观看爽| 婷婷丁香在线五月| 久久久久久大精品| av.在线天堂| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 精品福利观看| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲av成人av| 又紧又爽又黄一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品久久久久久久电影| 成人亚洲精品av一区二区| 听说在线观看完整版免费高清|