氣調(diào)貯藏對黃桃風味和軟化及褐變相關(guān)酶的影響

何雙　李高陽　蔣成　韓曉磊

摘要以黃桃為試驗材料，研究氣調(diào)貯藏對黃桃風味相關(guān)酶（乙醇脫氫酶、酰基轉(zhuǎn)移酶和脂氧合酶）、軟化相關(guān)酶（多聚半乳糖醛酸酶和內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶）、褐變相關(guān)酶（多酚氧化酶和過氧化物酶）和MDA含量的影響。結(jié)果表明，氣調(diào)貯藏能延緩乙醇脫氫酶活性的降低，抑制酰基轉(zhuǎn)移酶活性的下降，減少脂氧合酶活性的降低，能減少多聚半乳糖醛酸酶活性的上升，抑制內(nèi)切一β-1，4-葡聚糖酶活性升高，減少黃桃MDA含量的上升，抑制多酚氧化酶和過氧化物酶活性的增加。因此，氣調(diào)貯藏能緩解黃桃果實風味劣變，減少果實硬度降低，延緩了果實的衰老和褐變，從而延長黃桃的保質(zhì)期。

關(guān)鍵詞 黃桃;氣調(diào)貯藏;風味;軟化;褐變;酶

中圖分類號 S662.1;TS255.3

文獻標識碼 1

文章編號 1007-5739（2019）07-0202-04

黃桃含有豐富的胡蘿卜素、番茄黃素、番茄紅素、Vc、膳食纖維、鐵、鈣及多種微量元素，營養(yǎng)價值豐富，香氣濃郁，美味可口，深受廣大消費者喜愛。發(fā)展黃桃產(chǎn)業(yè)具有可觀的經(jīng)濟價值。黃桃不耐貯藏且上市時間集中，恰逢高溫時期，在常溫下一般只能存放7d左右，可供鮮食期短。采摘后的黃桃果實易發(fā)生果肉軟化，出現(xiàn)異味和褐變等現(xiàn)象。黃桃屬于呼吸躍變型果實，采收后有雙呼吸高峰和乙烯釋放高峰出現(xiàn)。采用氣調(diào)貯=藏能有效保持黃桃的品質(zhì)，達到延長保鮮期的目的2，但氣調(diào)貯藏黃桃保鮮機理未見報道?，F(xiàn)以炎陵黃桃為試驗材料，在本人已發(fā)表論文《氣調(diào)貯藏黃桃參數(shù)的優(yōu)化及對品質(zhì)的影響》的基礎上，研究氣調(diào)貯藏黃桃對風味相關(guān)酶（乙醇脫氫酶、?；D(zhuǎn)移酶和脂氧合酶）、軟化相關(guān)酶（多聚半乳糖醛酸酶和內(nèi)切B-1，4-葡聚糖酶）、褐變相關(guān)酶（多酚氧化酶和過氧化物酶）活性的影響，以期為氣調(diào)貯藏保鮮黃桃提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料。試驗黃桃采自湖南省炎陵縣，按照《鮮桃》（NY一T586-2002）標準要求，選取成熟度為八成熟、果實大小均勻、著色一致、無機械損失、無病蟲害的果實作為試驗材料，當天晚上放入湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工所冷藏庫實驗室，4C預冷，備用。從長沙方罡氣體有限公司購買1瓶標準氣，氣體成分指標是3%（體積分數(shù)）氧氣.9%（體積分數(shù)）二氧化碳。從高橋市場上購買一打20L保鮮袋和繩子，從湖南探源生物科技有限公司購買1-甲基丙烯。

1.1.2儀器。AL204型電子分析天平，DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，紫外分光光度計UV-1700。

1.2試驗方法

黃桃按照當?shù)貍鹘y(tǒng)采收期采收，次日運回實驗室，分裝于容量20L保鮮袋內(nèi)，每袋裝果約10kg，置于（4.0+0.5）9C的冷庫內(nèi)，24h后用纖維繩封口。每3d將一定量的1-MCP放置于袋內(nèi)，然后再將之前配好并放置于鋼瓶內(nèi)的N2、CO2、O2混合氣體充滿袋內(nèi)，每次重復處理2次，每次充10L氣體，以通人10L空氣為對照。黃桃氣調(diào)貯藏參數(shù)：3%（體積分數(shù)）氧氣，9%（體積分數(shù)）二氧化碳，1-MCP濃度為30μLL。每3d隨機取樣2個。

1.3檢測指標與方法

1.3.1乙醇脫氫酶（ADH）活性的測定。粗酶液提?。悍Q取約0.2g樣品，加入2mLPBS（pH值6.0，0.1mol/L）進行冰浴勻漿。16000r/min，4C離心20min，取上清液置冰上待測。

ADH測定操作：①空白管。在1mL石英比色皿中依次加人100μL蒸餾水、800μL磷酸緩沖液（含DTT、PVPP、EDTA、Triton一X-100）和100μL乙醛溶液，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1和A2。△A空白管=A1-A2。②測定管。在1mL石英比色皿中依次加人100μL上清液、800μL磷酸緩沖液（含DTT、PVPP、EDTA、Triton一X-100）和100μL乙醛溶液，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A3和A4?！鰽測定管=A3-A4。樣本質(zhì)量記為w。

酶活性單位定義：25C中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmolNADH為1個酶活單位。

計算公式如下：

ADH（μmol/（min.g鮮重））=1.61x（△A測定管一OA空白管）：W1.3.2?；D(zhuǎn)移酶（AAT）活性的測定。粗酶液提?。悍Q取約0.1g組織，加入1mL提取液（0.5mol/LTris一HCl，pH值8.0，含PVP、Trixton-100）冰浴勻漿。8000r/min，4C離心10min，取上清液置冰上待測。

AAT測定操作：①工作液的配制。臨用前在試劑（乙酰CoA、MgCl2）瓶中加入22.5mL溶液（0.5mol/LTris一HCl，pH值8.0，含正丁醇），充分混勻待用。②試劑DTNB的配制。臨用前加無水乙醇1.25mL充分溶解待用。③空白管。在Ep管中加人50μL提取液和900μL工作液，充分混勻，35C反應15min，加人50μL試劑DTNB，充分混勻，25C靜置10min，測定412nm處吸光值，記為A空白管。④測定管。在Ep管中加入50μL樣本和900μL工作液，充分混勻，35C反應15min，加入50μL試劑DTNB，充分混勻，25C靜置10min，測定412nm處吸光值，記為A測定管。OA=A測定管一A空白管。樣本質(zhì)量記為W。

酶活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB定義為一個酶活單位。

計算公式如下：

AAT（nmol/（min.g鮮重））=98.04x△A+W

1.3.3脂氧合酶（LOX）活性的測定粗酶液提取：稱取約0.1g組織，加入1mL（Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O、DTT、EDTA、PVPP）溶液進行冰浴勻漿。16000r/min，4C離心20min，取上清液置冰上待測。在試劑亞油酸鈉中加人25mLNa2HPO4.12H2O一NaH2P04.2H20溶液（振蕩混勻1min），在30C水浴中預熱10min以上。對照管：依次在比色皿中加入100μL樣本和900μLNa2HPO4.12H2O一NaH2PO4.2H2O溶液，30C反應30min后，記錄A對照。測定管：依次在石英比色皿中加入100μL樣本和900μL亞油酸鈉溶液，30C反應30min后，記錄A測定。AA=A測定一A對照。樣本質(zhì)量記為W。

酶活性單位定義：259C中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.01個單位為1個酶活單位。

計算公式如下：

LOX（U/g鮮重）=33.33x△A+W

1.3.4多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的測定酶液提?。悍Q取約0.1g樣品，加人1mL提取液（醋酸一醋酸鈉緩沖液，含PVP、DTT）進行冰浴勻漿。16000r/min，4C離心10min，取上清液置冰上待測。測定操作：對照管依次加人煮沸樣本100μL和蒸餾水400μL，40C水溶30min，然后再加試劑（3，5-二硝基水楊酸、NaOH、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉）500μL;測定管依次加入樣本100μL和試劑果膠酸400μuL，40C水溶30min，然后再加試劑（3，5-二硝基水楊酸、NaOH、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉）500μL。對照管及測定管均沸水浴5min，冷卻，蒸餾水調(diào)零，1mL玻璃比色皿測定540nm處吸光值A，△A=A測定管一A對照管。每個測定管設1個對照管。樣本質(zhì)量記為W。

酶活性單位定義：在40C、pH值6.0條件下，每克樣本每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

計算公式如下：

PG活性（mg/（h.g鮮重））=2.523x（OA+0.008）+W

1.3.5內(nèi)切一β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性的測定。粗酶液提?。悍Q取0.1g組織，加入1mL提取液（酸酸一無水醋酸鈉溶液）進行冰浴勻漿。8000r/min，4°C離心10min，置冰上待測。測定操作：對照管加入樣本50μL和羧甲基纖維素鈉溶液500μL，混勻，37C準確水浴2h，再加入DNS試劑（3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、重蒸酚、無水亞硫酸鈉溶液）1000μL;測定管加入樣本50μL和蒸餾水500μL，混勻，37C準確水浴2h，再加入DNS試劑（3，5-二硝基水楊酸.氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、重蒸酚、無水亞硫酸鈉溶液）1000μL，對照管和測定管均90C水浴10min，冷卻，蒸餾水調(diào)零，測定540nm處吸光值A，計算△A=A測定管一A對照管。樣本質(zhì)量記為W。

酶活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg葡萄糖定義為一個酶活力單位。

計算公式如下：

Cx活力（μg/（min.g鮮重））=14.305x（△A+0.0673）：W1.3.6多酚氧化酶（PPO）活性的測定。粗酶液提?。悍Q取約0.1g組織，加入1mL提取液（KH2PO4、K2HPO4.3H2O溶液，含PVP）進行冰浴勻漿。8000r/min，4C離心10min，取上清液置冰上待測。測定操作：測定管依次加人樣本180μL、溶液（KH2PO4、K2HPO4.3H20）720μL和鄰苯二酚溶液180μL，對照管依次加人煮沸的樣本180μL、（KH2PO4、K2HPO4.3H20）溶液720μL、蒸餾水180μL，然后測定管和對照管均于25C水浴10min后，于95C水浴5min充分混勻，10000r/min，25C離心10min，取上清液，525nm處檢測測定管和對照管吸光度?！鰽=A測定管一A對照管。樣本質(zhì)量記為W。

酶活性單位定義：每分鐘每克組織在1mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。

計算公式如下：

PPO（U/g鮮重）=60x▲A+W

1.3.7過氧化物酶（POD）活性的測定。粗酶液提?。悍Q取約0.1g組織，加人1mL提取液（Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4溶液）進行冰浴勻漿。8000r/min，4C離心10min，取上清液，置冰上待測。工作液的配制：在50mL醋酸鈉和冰醋酸溶液中加入28μL愈創(chuàng)木酚溶液和19μL過氧化氫，混勻;25C預熱10min以上;在比色皿中加入50μL樣本和950μL工作液，混勻，記錄470nm下1min時吸光值A1和2min后的吸光值A2。計算OA=Ax一A1。樣本質(zhì)量記為W。

酶活性單位定義：1g組織在1mL反應體系中每分鐘Axo變化0.01為一個酶活力單位。

計算公式公式如下：.

POD（U/g鮮重）=2000x△A+W

1.3.8丙二醛（MDA）含量的測定。MDA提?。悍Q取約0.1g樣本，加入1mL提取液（Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4溶液）進行冰浴勻漿.8000r/min，4°C離心10min，取上清液置冰上待測。

測定步驟：①吸取0.6mLTCA、TBA溶液于1.5mL離心管中，再加人0.2mL樣本，混勻。②95C水浴中保溫30min，置于冰浴中冷卻，10000r/min，25C，離心10min。③吸取上清液于比色皿中，測定532nm和600nm處的吸光度，記為As22和A0o0，AA一=As2-A00o樣本質(zhì)量記為W。

計算公式如下：

MDA含量（nmol/g鮮重）=25.8x△A+W

2結(jié)果與分析

2.1氣調(diào)貯藏對黃桃風味相關(guān)酶活性的影響

LOX途徑是次生物質(zhì)代謝的一個重要途徑，許多研究表明，L0X途徑及其產(chǎn)物參與了乙烯的生物合成，并與果實的成熟衰老密切相關(guān)。在番茄、蘋果、草莓等果實中也有相同的研究報道，并已基本明確這些果品中醛類、醇類、酯類香氣物質(zhì)的合成是由脂肪酸的LOX氧化途徑產(chǎn)生。LOX途徑中生物活性酶的具體作用為不飽和脂肪酸是LOX底物，生成過氧化不飽和脂肪酸;HPL以LOX的氧化產(chǎn)物為底物，裂解產(chǎn)生醛類物質(zhì)和含氧酸;醛類物質(zhì)在ADH作用下生成醇類物質(zhì);AAT把醇類物質(zhì)和相應的酰基輔酶A縮合作用形成酯類物質(zhì)，

2.1.1氣調(diào)貯藏對黃桃乙醇脫氫酶（ADH）活性的影響。ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過程中起著重要作用。由圖1可看出，貯藏前13d，氣調(diào)貯藏組和對照組果實ADH活性均呈增加趨勢。從第13天開始，氣調(diào)貯藏組和對照組果實ADH活性逐漸降低。在整個貯藏過程中，氣調(diào)貯藏處理果實ADH活性均高于對照處理，且隨著貯c藏時間的延長，差異越來越顯著。這充分說明氣調(diào)貯藏處理提高了果實ADH活性。ADH是將相應底物轉(zhuǎn)化為醇類物質(zhì)的一種酶。因此，氣調(diào)貯藏處理果實芳樟醇含量相對較高可能與其果實ADH活性升高有關(guān)。

2.1.2氣調(diào)貯藏對黃桃?；D(zhuǎn)移酶（AAT）活性的影響。AAT是多功能蛋白，主要負責催化生物體內(nèi)各種?；腿ヵ；磻诨虮磉_、代謝和信號傳導中具有重要作用4。由圖2可以看出，貯藏前13d，對照組果實和氣調(diào)貯藏組果實AAT活性逐漸提高，這是黃桃后熟的表現(xiàn)。第13天開始，2個貯藏組AAT活性逐漸降低，但對照組降低得更顯著，與氣調(diào)組差距越來越大。AAT參與果實風味物質(zhì)代謝，與酯類的生物合成有著密切的關(guān)系?？梢?，黃桃果實貯藏后期風味的喪失可能與AAT活性喪失有關(guān)。

2.1.3氣調(diào)貯藏對黃桃脂氧合酶（LOX）活性的影響。脂氧合酶催化不飽和脂肪酸氧化反應，導致膜脂過氧化，是果實采后成熟和衰老過程中重要的酶。該酶以亞油酸和亞麻酸為底物，生成的氧化產(chǎn)物能夠?qū)е轮|(zhì)過氧化，破壞膜完整性，還可以在相關(guān)酶的作用下，生成揮發(fā)性物質(zhì)、茉莉酸、乙烯I）。由圖3可以看出，在整個貯藏過程中，氣調(diào)組黃桃脂氧合酶活性比對照組相應高，2個處理組的黃桃果實酶活性在貯藏前期和中期逐漸升高，在第16天達到最高值。在貯藏后期，表現(xiàn)為小幅下降。可見，氣調(diào)貯藏處理提高了黃桃脂氧合酶的活性，延緩了黃桃在貯藏期間風味物質(zhì)的劣變。

2.2氣調(diào)貯藏對黃桃軟化相關(guān)酶活性的影響

2.2.1氣調(diào)貯藏對黃桃多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的影響。果膠的組成與含量決定果實的硬度，果膠酶催化果膠的代謝直接影響果實硬度。果膠酶包括果膠酯酶和多聚半乳糖醛縮酶6。PG酶是分解果膠的關(guān)鍵酶，催化果膠分子中x一（1，4）一聚半乳糖醛酸的裂解，其主要作用是PG酶在果實軟化期間減弱了果實細胞相互之間的粘合力，細胞從中膠層處分離開來，同時改變細胞壁的伸縮性和可塑性，降低總果膠和原果膠的含量（7-8。由圖4可以看出，果實在貯藏期間PG活性基本呈上升趨勢，對照均高于氣調(diào)組。貯藏前期，氣調(diào)組和對照組的PG活性差異不顯著，上升幅度不大，貯藏13d后，對照組PG活性上升速度明顯加快，而氣調(diào)組，上升速度明顯不如對照組，導致2組之間PG活性的差距越來越大。結(jié)果表明，氣調(diào)貯藏能減少PG活性的升高，保持果實硬度。

2.2.2氣調(diào)貯藏對黃桃內(nèi)切一β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性的影響。Cx主要作用于非晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物，隨機水解糖苷鍵，將其分解成葡萄糖、纖維二糖纖維三糖和其他寡聚體。由圖5可以看出，2種貯藏處理組對黃桃果實的CX活性變化趨勢基本一致，對照果實與氣調(diào)貯藏果實都在貯藏至第13天時出現(xiàn)了CX活性最大值，氣調(diào)貯藏組對CX活性有一定的抑制作用，并且隨著貯藏時間的延長，2組CX活性相差越大。這說明貯藏時間越久，氣調(diào)貯藏抑制效果越明顯。

2.3氣調(diào)貯藏對黃桃褐變相關(guān)酶活性的影響

2.3.1氣調(diào)貯藏對黃桃多酚氧化酶（PPO）活性的影響。多酚氧化酶是一種含銅的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，是引起果實褐變的關(guān)鍵酶。多酚氧化酶在黃桃果實中含量相當高，能引起黃桃變質(zhì)和腐爛0，2種貯藏方式對多酚氧化酶活性的影響如圖6所示?？傮w上，黃桃隨著貯藏時間的延長，活性在貯藏前期逐漸降低，在第7天達到最低值，隨后呈上升趨勢一直到貯藏末期。氣調(diào)貯藏組黃桃的多酚氧化酶活性較對照組黃桃的低。這說明氣調(diào)貯藏處理可以抑制多酚氧化酶的活性，有效延緩果實衰老，延長了果實貯藏期。

2.3.2氣調(diào)貯藏對黃桃過氧化物酶（POD）活性的影響。過氧化物酶可催化過氧化氫、氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，其活性變化可作為果蔬成熟和衰老的標志。過氧化物酶（POD）是一種含銅蛋白質(zhì)，POD也可以催化酚類物質(zhì)發(fā)生褐變。POD一方面作為膜保護酶，清除組織中H2O2，可減輕H2O2對膜脂的傷害;另一方面可利用H2O2釋放的O2氧化酚類物質(zhì)，再經(jīng)過一系列反應，最后導致果實褐變的發(fā)生叫。由圖7可以看出，2組黃桃貯藏前期，過氧化物酶活性逐漸降低，貯藏第7天達到最低值，隨后逐漸升高。隨著貯藏時間的延長，黃桃產(chǎn)生的自由基越來越多，從而誘導了POD活性增加。但氣調(diào)貯藏的黃桃POD活性明顯低于對照組，說明氣調(diào)貯藏可以有效抑制POD的活性。

2.4氣調(diào)貯藏對黃桃丙二醛（MDA）含量的影響

植物在逆境或衰老條件下，會發(fā)生膜脂的過氧化過程。MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物之一，其濃度表示脂質(zhì)過氧化強度和膜系統(tǒng)傷害程度，故為逆境生理指標。隨著果實的成熟和在低溫脅迫條件下，果實MDA含量逐漸升高21。氣調(diào)貯藏對貯藏期間黃桃果實的MDA含量有一定的影響作用。由圖8可看出，在貯藏條件下，2組黃桃隨著貯藏時間的延長，果實MDA含量呈上升趨勢，這是果實后熟過程的一個反映。隨著貯藏時間的延長，2個處理組果實的MDA含量差異越來越大。氣調(diào)貯藏對黃桃果實的MDA含量有一定的影響作用，氣調(diào)貯藏的黃桃MDA含量較對照組含量低，說明氣調(diào)貯藏能抑制貯藏期間黃桃MDA含量的提高，降低脂質(zhì)過氧化強度，減少細胞膜系統(tǒng)傷害程度，使黃桃果實腐爛程度降低。

3結(jié)論與討論

通過比較黃桃氣調(diào)貯藏組和對照組的乙醇脫氫酶、?；D(zhuǎn)移酶和脂氧合酶的活性，結(jié)果表明，氣調(diào)貯藏能延緩乙醇脫氫酶活性的降低，抑制?；D(zhuǎn)移酶的快速下降，減少脂氧合酶活性的降低。這3種酶活性的大小直接影響黃桃風味物質(zhì)（LOX途徑）的多少。在氣調(diào)藏后期，黃桃能在一定程度上維持果實一定的風味，與這3種酶保持相當活力密切相關(guān)。通過比較氣調(diào)貯藏組和對照組的多聚半乳糖醛酸酶和內(nèi)切一β-1，4-葡聚糖酶的活性及MDA含量，可以看出，氣調(diào)貯藏能減少PG活性的上升，抑制內(nèi)切一β-1，4-葡聚糖酶活性的作用，減少果實MDA含量的快速上升。因此，氣調(diào)貯藏對降低細胞的氧化作用及膜脂過氧化作用.維持細胞壁及膜的完整性、減緩膜結(jié)構(gòu)的氧化作用、維持黃桃果實較高的硬度有一定效果。通過比較黃桃氣調(diào)貯藏組和對照組的多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，結(jié)果表明，氣調(diào)貼藏能抑制多酚氧化酶和過氧化物酶活性的增加。酶促褐變是由于植物組織內(nèi)的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下，鄰位的酚氧化為醌，醌很快聚合成為褐色素而引起組織褐變。隨著貯藏時間的延長，黃桃發(fā)生衰老等因素刺激活性氧增加，從而引起果實褐變3）。因此，氣調(diào)貯藏能延緩多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，延緩黃桃的衰老與褐變。

綜上所述，氣調(diào)貯藏能有效減少黃桃果實中的乙醇脫氫酶酰基轉(zhuǎn)移酶和脂氧合酶活性的降低，抑制多聚半乳糖醛酸酶和內(nèi)切一β-1，4-葡聚糖酶活性的上升，減少果實MDA含量的快速上升，減少多酚氧化酶和過氧化物酶活性的增加。因此，氣調(diào)貯藏能維持其細胞的正常代謝，減少風味劣變的發(fā)生;同時可減緩黃桃軟化速度，延緩了果實衰老和褐變，從而延長黃桃的貯藏期。

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