電化學(xué)分析法快速測(cè)定食品中的呋喃

柴曉玲，郝雅茹，李書國*

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

呋喃是最簡單的含氧五元雜環(huán)化合物，具有親脂性和高度揮發(fā)性（沸點(diǎn)31.4 ℃），另有弱刺激和麻醉作用，是具有代謝毒性、生理毒性和基因毒性的潛在致癌物。2004年，美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐盟食品安全局（EU Food Safety Authority，EFSA）先后從各類經(jīng)過加熱處理的食品中發(fā)現(xiàn)了污染物呋喃[1-3]。相關(guān)報(bào)道發(fā)表后，引起了國際社會(huì)的高度關(guān)注。呋喃已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸類為可能使人類致癌的“2B”組物質(zhì)[4]。其易通過呼吸等多種途徑被人體吸收，進(jìn)而引起惡心、頭暈、呼吸衰竭、血壓下降等癥狀，甚至誘發(fā)體內(nèi)癌變[5-10]。呋喃在大多數(shù)熱加工食品如咖啡、湯類、以及嬰幼兒食品中等均有不同程度的檢出，其中咖啡內(nèi)含量最高。2018年5月，美國法院最終裁定，要求星巴克等咖啡加工、零售商在加州銷售的咖啡產(chǎn)品須加注致癌風(fēng)險(xiǎn)警告標(biāo)識(shí)?？梢?，加熱食品中具有致癌風(fēng)險(xiǎn)的副產(chǎn)物的危害受到社會(huì)高度重視。食品中呋喃的形成機(jī)制、減控方法、危害消除，以及快速檢測(cè)方法是當(dāng)今國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，因此，需要研究如何降低食品中呋喃的形成，并建立一種簡便、靈敏度高的呋喃的快速檢測(cè)方法。

目前，國內(nèi)外常用的食品中呋喃檢測(cè)方法主要有頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace injection gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS）法、固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及頂空-固相微萃取-氣相色譜-火焰離子化法[11-14]。以上3 種方法雖然準(zhǔn)確、靈敏度高，但儀器和人員成本較高，而且所測(cè)食品需要進(jìn)行加熱預(yù)處理，可能會(huì)導(dǎo)致分析過程中生成新的呋喃，從而影響結(jié)果[15-16]。電化學(xué)檢測(cè)方法成本低、操作簡單且靈敏度高，并且可以實(shí)現(xiàn)快速高效監(jiān)測(cè)和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究呋喃在玻碳電極表面的電化學(xué)反應(yīng)過程，建立一種快速測(cè)定痕量呋喃的電分析方法，并應(yīng)用于實(shí)際食品中呋喃的快速精確測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

速溶咖啡、麻花、江米條 石家莊本地超市。

呋喃（純度99.5%） 成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；乙腈、無水乙醇、四氫呋喃（均為分析純）天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無水高氯酸鋰 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；丙酮（分析純） 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；二甲基亞砜（分析純） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LK98BII型微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng) 天津蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；玻碳電極、鉑絲電極、Ag/AgCl電極、電解杯 上海CHI儀器公司；KQ 2200型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；FA 2204型電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；GZX-9070 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TGL-10B高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；AI 3000II型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、AI 3000自動(dòng)進(jìn)樣器美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 玻碳電極的預(yù)處理

用粒徑為0.05 μm的Al2O3粉末將玻碳電極表面打磨拋光至鏡面，用去離子水清洗后依次在50%硝酸溶液、無水乙醇、去離子水中超聲清洗2 min，用氮?dú)獯蹈伞Ｔ谝訩3[Fe(CN)6]為探針的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描，至氧化還原峰峰差值在90 mV以下，然后在1 mol/L H2SO4溶液中對(duì)玻碳電極進(jìn)行活化，用快速循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖，最后用去離子水清洗后吹干備用。

1.3.2 呋喃標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

低溫條件下快速取31 μL呋喃標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL乙腈中得到0.1 mol/L呋喃溶液，密封后放入冰箱保存。

1.3.3 呋喃標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

以直徑為3 mm的玻碳電極為工作電極、Ag/AgCl為參比電極、鉑絲電極為對(duì)電極，以0.15 mol/L的LiClO4-乙腈溶液為電解液，加入不同量的呋喃標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其呈梯度濃度，在1.3～2.4 V掃描電位范圍內(nèi)，脈沖增量0.005 V、脈沖間隔0.3 s、脈沖幅度和脈沖寬度均為0.05 V，在冰水中用微分脈沖伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，控制待測(cè)物環(huán)境溫度在2～5 ℃，每個(gè)濃度測(cè)定3 次，并記錄相應(yīng)的峰電流值，取其平均值作為該呋喃濃度對(duì)應(yīng)的氧化電流值。考察峰電流值與呋喃濃度的關(guān)系。

1.3.4 樣品中呋喃的提取

1.3.4.1 速溶咖啡中呋喃的提取

準(zhǔn)確稱量5 g速溶咖啡粉末于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈攪拌數(shù)分鐘，在冰水中超聲5 min后，4 500 r/min離心20 min，收集上清液后殘?jiān)性偌尤?0 mL乙腈，重復(fù)上述操作，取2 次上清液于冰箱中低溫貯存?zhèn)溆肹19]。

1.3.4.2 麻花、江米條中呋喃的提取

分別稱取4 g打碎的麻花、江米條粉末，加入15 mL乙腈后攪拌數(shù)分鐘，然后在冰水中超聲5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，殘?jiān)性偌尤?5 mL乙腈重復(fù)以上操作，合并2 次上清液，于冰箱中低溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 電化學(xué)傳感器測(cè)定食品中的呋喃

按照1.3.3節(jié)方法對(duì)食品中的呋喃進(jìn)行測(cè)定，并記錄其電化學(xué)響應(yīng)電流值，每種提取液做3 次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值作為測(cè)定結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各個(gè)樣品中呋喃的含量。

1.3.6 HS-GC-MS法測(cè)定食品中呋喃

1.3.6.1 頂空條件

平衡溫度70 ℃，平衡時(shí)間30 min，樣品瓶低速振搖；定量環(huán)溫度100 ℃，傳輸線溫度110 ℃，瓶加壓0.5 min；頂空瓶內(nèi)壓力103.4 kPa；填充定量環(huán)0.5 min；定量環(huán)平衡0.5 min；進(jìn)樣時(shí)間1 min，GS循環(huán)30 min。

1.3.6.2 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，1 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱溫升溫程序：以50 ℃為初始溫度，保持1 min后以10 ℃/min升溫速率升至250 ℃，保持12.5 min。以氮?dú)鉃檩d氣，流速為1 mL/min；以分流比20∶1分流進(jìn)樣。

1.3.6.3 質(zhì)譜條件

離子源：電子電離源，電子能量70 eV；離子源溫度：250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描方式：全譜掃描（m/z 25～300）。

1.3.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測(cè)定

準(zhǔn)確配制所需呋喃濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定，記錄各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的圖譜峰面積，并與對(duì)應(yīng)的呋喃濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品提前在4 ℃條件下冷藏?cái)?shù)小時(shí)，快速稱取打磨好的樣品粉末于二甲基亞砜中，用1.3.4節(jié)方法提取呋喃，進(jìn)行HS-GC-MS檢測(cè)，每個(gè)樣品測(cè)定3 次，取其平均值，由上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中呋喃濃度，并與電化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異分析（P＜0.05，差異顯著），并運(yùn)用Orign8.6繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 呋喃在玻碳電極上的電化學(xué)行為

圖1 呋喃在玻碳電極上的循環(huán)伏安圖Fig. 1 Cyclic voltammogram of furan on glassy carbon electrode

通過對(duì)空白溶液和呋喃標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到呋喃在玻碳電極的循環(huán)伏安圖（圖1），對(duì)其電化學(xué)反應(yīng)行為進(jìn)行分析。電位區(qū)間1.3～2.4 V，掃描速度50 mV/s。

圖1a顯示空白溶液中無氧化峰。圖1b顯示，呋喃在1.80 V左右出現(xiàn)氧化峰，并且反向掃描無還原峰出現(xiàn)，表明呋喃能夠在玻碳電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，并且不可逆。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，雙鍵部分發(fā)生氧化反應(yīng)。由圖1b、c可知，峰電流隨呋喃濃度的增大而增大，其電流峰高與呋喃濃度呈一定比例，表明該方法可以對(duì)呋喃進(jìn)行定量分析。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 溶劑的選擇

圖2 溶劑對(duì)呋喃在電極表面的微分脈沖掃描曲線的影響Fig. 2 Effect of different solvents on differential pulse scanning curve of furan on electrode surface

溶劑的種類對(duì)呋喃的氧化峰峰形有一定影響，進(jìn)而影響電極的吸附作用，因此需要測(cè)試呋喃在不同溶劑中的出峰情況。溶劑的選擇應(yīng)滿足以下要求：呋喃的溶解度要好，能與呋喃形成均一體系；具有良好的介電特性，能很好地溶解電解質(zhì)LiClO4，使其具有良好的導(dǎo)電性。由于呋喃易溶于多種有機(jī)溶劑，而不溶于水，所以選擇非水溶劑作為電解溶劑。將0.1 mmol/L的呋喃溶液分別在乙腈、乙醇、丙酮以及二甲基亞砜中進(jìn)行檢測(cè)，圖2結(jié)果表明，呋喃在乙腈中峰形最好，靈敏度最高。由圖2可以看出，乙醇、乙腈和二甲基亞砜出峰位置依次后移，可能由于極性大小對(duì)溶解度有影響；乙腈的峰電流與乙醇相比較高，可能是由于乙醇的介電常數(shù)（ε=24.3）小于乙腈（ε=37.5），電解質(zhì)不易在其中解離，進(jìn)而影響電子傳遞效果造成的。所以綜合考慮，選取乙腈作為溶劑。

2.2.2 電參數(shù)的影響

2.2.2.1 電位增量的影響

電位增量分別設(shè)為0.001、0.003、0.005、0.008 V，對(duì)0.1 mmol/L的呋喃進(jìn)行微分脈沖掃描，觀察峰電位及峰電流的變化。由圖3可知，電位增量對(duì)峰電位的影響不大，但對(duì)峰形有一定影響，峰電流隨電位增量的增大而增大，并且氧化峰先變窄后變寬?？紤]峰形以及峰電流大小兩個(gè)因素，故選擇電位增量為0.005 V。

圖3 電位增量對(duì)呋喃氧化峰電流值的影響Fig. 3 Effect of potential increment on oxidation peak current of furan

2.2.2.2 脈沖間隔的影響

圖4 脈沖間隔對(duì)呋喃氧化峰電流值的影響Fig. 4 Effect of pulse interval on oxidation peak current of furan

同樣選用0.1 mmol/L的呋喃進(jìn)行測(cè)定，由圖4可以看出，隨著脈沖時(shí)間的延長，峰電流明顯減小，并且峰形變寬，為得到更好的峰形，同時(shí)減少誤差，故選用0.3 s為脈沖間隔。

2.2.3 電解質(zhì)濃度的影響

圖5 電解質(zhì)濃度對(duì)呋喃氧化峰電流值的影響Fig. 5 Effect of electrolyte concentration on oxidation peak current of furan

利用微分脈沖伏安法分別測(cè)定0.1 mmol/L的呋喃在電解質(zhì)濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L時(shí)的氧化電流，觀察電解質(zhì)濃度對(duì)呋喃氧化峰電流大小的影響，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?，響應(yīng)電流隨電解質(zhì)濃度的增加而增大，是由于隨著電解質(zhì)溶液濃度的增加，其導(dǎo)電性增加，所以峰電流增加。當(dāng)LiClO4濃度達(dá)到0.15 mol/L時(shí)，隨著電解質(zhì)濃度的增加，峰電流變化不大，說明導(dǎo)電率幾乎接近最大值，故電解質(zhì)濃度選用0.15 mol/L。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用微分脈沖伏安法（圖6）分別測(cè)定了呋喃濃度為0、2、5、10、20、40、60 μmol/L時(shí)的氧化電流值，各個(gè)濃度測(cè)定3 次，取其平均值為對(duì)應(yīng)呋喃濃度的氧化峰電流值，以響應(yīng)電流值為縱坐標(biāo)，呋喃濃度為橫坐標(biāo)，繪制呋喃的標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨著呋喃濃度的增大，響應(yīng)電流值逐漸增加，且在2～60 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，并滿足線性關(guān)系方程：Ip=0.046 6Cfuran＋0.565，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 8，最低檢測(cè)限為0.55 μmol/L（RSN=3）。Hoveidi等[20]在0.1 mol/L伯瑞坦-羅賓森緩沖溶液中測(cè)定呋喃，檢測(cè)限為3 μmol/L；Falciola等[21]以鉑基電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極，采用方波伏安法在乙腈-四丁基高氯酸銨中對(duì)呋喃進(jìn)行電化學(xué)研究，其檢測(cè)限為10～20 μmol/L。由此可見，本研究構(gòu)建的電化學(xué)傳感器靈敏度更好，可作為食品中痕量呋喃快速檢測(cè)的分析方法。

圖6 不同濃度呋喃的微分脈沖伏安曲線Fig. 6 Differential pulse voltammetry curves of furan at different concentrations

2.4 電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性、重復(fù)性與抗干擾性

對(duì)1×10－4mol/L的呋喃在玻碳電極的電流響應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定15 次，呋喃的氧化峰電流的平均值為（3.61±0.11）μA（n=15，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.24%）；分別配制3 批（每批2 支）不同濃度的呋喃標(biāo)準(zhǔn)溶液，用微分脈沖伏安法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，第1批兩組的氧化峰電流值變化為1.38%，第2、3批變化率分別為3.24%、1.52%，可見該電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

咖啡中含有丙烯酰胺、VB2以及易揮發(fā)成分吡咯[22-24]，麻花、江米條等油炸食品中亦含有丙烯酰胺[25]，所以探究了吡咯、丙烯酰胺以及VB2對(duì)呋喃氧化電流值的影響。以乙腈為溶劑，分別配制0.1 mol/L的吡咯、丙烯酰胺溶液，以及5×10－4mol/L VB2的NaCl溶液，密封后于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谄渌麠l件相同的情況下，采用微分脈沖伏安法測(cè)定空白呋喃標(biāo)準(zhǔn)溶液以及分別添加吡咯、丙烯酰胺和VB2的呋喃標(biāo)準(zhǔn)溶液的氧化電流值。添加以上3 種物質(zhì)后，呋喃的氧化峰電流值變化分別為5.94%、2.57%、4.71%，其中添加丙烯酰胺后，在1.2 V附近出現(xiàn)一個(gè)氧化峰，但其并不影響1.75 V處呋喃的峰電流值。可見該化學(xué)傳感器具有較好的抗干擾性。

2.5 樣品中呋喃的測(cè)定及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

按照1.3.4節(jié)所用方法分別處理樣品后得到樣品提取液，分別采用電化學(xué)方法和HS-GC-MS法檢測(cè)樣品中呋喃的含量，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。該法測(cè)得速溶咖啡中呋喃含量約為1 818 μg/kg，在EFSA公布的檢測(cè)范圍內(nèi)[26]；同時(shí)測(cè)得油炸食品麻花中含呋喃約97.5 μg/kg，江米條中呋喃含量約為81.8 μg/kg。HS-GC-MS法所測(cè)樣品結(jié)果與本法基本一致，3 種食品中呋喃含量結(jié)果相差在0.60%～0.72%之間。另外，本法的回收率在89.53%～105.27%之間，HS-GC-MS法回收率在91.73%～103.20%之間。兩者檢測(cè)結(jié)果基本一致，但電化學(xué)方法更加方便快捷。

表1 食品樣品中呋喃的加標(biāo)回收率結(jié)果Table 1 Recoveries of furan from spiked food samples

3 結(jié) 論

呋喃在玻碳電極表面的電化學(xué)行為表明，其在1.80 V處只發(fā)生氧化反應(yīng)而不發(fā)生還原反應(yīng)?；谖⒎置}沖伏安檢測(cè)技術(shù)，構(gòu)建了一種檢測(cè)速度快、靈敏度高的呋喃電化學(xué)分析方法，優(yōu)化了分析條件，確定了呋喃氧化響應(yīng)電流與濃度之間的數(shù)學(xué)模型、線性范圍以及檢測(cè)限等檢測(cè)參數(shù)，該方法可以用于實(shí)際樣品中呋喃的檢測(cè)。另外，該方法具有檢測(cè)成本低、檢測(cè)速度快、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、抗干擾性強(qiáng)以及樣品前處理簡單的優(yōu)點(diǎn)，在食品安全監(jiān)測(cè)方面具有廣闊前景。