基于高通量測(cè)序技術(shù)分析朝鮮族傳統(tǒng)米酒及其酒曲中微生物群落多樣性

寧亞麗，吳 躍*，何 嬙，徐帥哲，陳 艷

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

米酒作為我國(guó)一種傳統(tǒng)發(fā)酵酒，通常以米類作物為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成，其不僅風(fēng)味獨(dú)特，還富含豐富營(yíng)養(yǎng)成分，具有特色食療功能[1]，在我國(guó)南方和北方一些地區(qū)非常盛行。近年來(lái)，朝鮮族米酒作為東北吉林延邊朝鮮族的一種特色傳統(tǒng)發(fā)酵米酒，因其米香濃郁，較南方米酒酸甜可口，口感醇和，類似飲料風(fēng)味，深受男女老少喜愛(ài)，逐漸在我國(guó)流行。

我國(guó)米酒發(fā)展有悠久的歷史，不同區(qū)域的米酒呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味和口感，其中具有代表性的傳統(tǒng)米酒有孝感米酒、福建紅曲米酒、信陽(yáng)米酒、陜北米酒、朝鮮族米酒等。孝感米酒是湖北地區(qū)一種米酒，是以優(yōu)質(zhì)糯米為原料和傳統(tǒng)鳳窩酒曲發(fā)酵而成，其酒白如玉液，甜潤(rùn)可口；福建紅曲米酒是由糯米和紅米為原料，紅曲為發(fā)酵劑釀造而成，以色紅、味醇、香濃著稱；信陽(yáng)米酒由糯米為原料，利用小曲發(fā)酵而成，甘飴可口；陜北米酒主要由黃米或小米為原料，與當(dāng)?shù)鼐魄l(fā)酵而成，呈黃色，口味略甜且?guī)姿嵛丁６r族米酒是一種以粳米或糯米為主要原料，利用當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)酒曲為發(fā)酵劑，經(jīng)過(guò)浸米、熬煮（或蒸米）、糖化、發(fā)酵、過(guò)濾、調(diào)配等工序釀制而成，其乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%～6%[2]，口感酸甜可口，但略偏酸，因其酒體為乳白色或微黃色，又被稱為濁酒。其酒曲是以糯米粉和發(fā)芽玉米粉為原料，加水混合制成曲坯，自然接種環(huán)境中的微生物而成。

中國(guó)米酒文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，但關(guān)于朝鮮族米酒記錄的文獻(xiàn)很少。而與我國(guó)朝鮮族米酒相似的韓國(guó)米酒目前在世界范圍內(nèi)享受聲譽(yù)，韓國(guó)對(duì)其米酒和酒曲Nuruk進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)Nuruk酒曲中絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌對(duì)韓國(guó)米酒的品質(zhì)和風(fēng)味起到至關(guān)重要的作用[3]。據(jù)報(bào)道，韓國(guó)米酒具有多種功能特性，包括抗癌、抗高血壓、抗氧化，促進(jìn)血液循環(huán)等功效[4-5]。而我國(guó)對(duì)朝鮮族米酒及其酒曲研究?jī)H主要集中在其釀造及制曲工藝上[2,6]，對(duì)米酒及其酒曲中微生物種類研究很少。高通量測(cè)序技術(shù)是目前研究微生物多樣性中應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù)，不僅能夠快速地分析復(fù)雜微生物群落多樣性，還能檢測(cè)到低存在率及不可培養(yǎng)的微生物，現(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于酸奶[7]、泡菜[8]、白酒[9]、醋[10]等生物群落結(jié)構(gòu)研究，因此本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)研究朝鮮族酒曲及其發(fā)酵后米酒中微生物群落多樣性。

本研究以朝鮮族米酒及其酒曲為研究對(duì)象，采用Ilumina HiSeq和Illunina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行測(cè)序，更全面地呈現(xiàn)朝鮮族米酒及其酒曲的微生物群落多樣性，剖析各類微生物的結(jié)構(gòu)比例，明確優(yōu)勢(shì)菌群；以此更好地提高朝鮮族米酒品質(zhì)，推動(dòng)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，為現(xiàn)代化釀酒新工藝的建立提供理論依據(jù)，對(duì)推廣民族特色發(fā)酵食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米酒原料為東北粳米（珍珠米），產(chǎn)自黑龍江通河；酒曲為采集自吉林延邊朝鮮族自治州家庭當(dāng)年手工制作的新酒曲。

DNA提取試劑盒（DP328）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP208） 北京天根生物科技有限公司；強(qiáng)力土壤?DNA提取試劑盒 美國(guó)MOBIO公司；Taq酶、引物等 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；精密膜過(guò)濾器 煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；C1000型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc 2000型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；水平電泳儀、電泳槽 北京市六一儀器廠；5427R型低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；SI-A256型渦旋機(jī) 美國(guó)Scientific Industries公司；MiSeq PE300測(cè)序儀、HiSeq 2500測(cè)序儀 美國(guó)Illuimina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備及采集

參照文獻(xiàn)[2]方法，結(jié)合當(dāng)?shù)毓に囍苽涑r族米酒。具體為：先將粳米浸潤(rùn)5～6 h，然后以質(zhì)量比1∶5的米水比熬煮至粥狀，攤冷冷卻至室溫，按大米質(zhì)量的3%加曲拌勻后，入罐密封發(fā)酵，溫度32 ℃，發(fā)酵3 d，得米白色酒醪，于4 ℃冷藏3 d，過(guò)80 目篩進(jìn)行粗濾得米酒樣品CL；在此基礎(chǔ)上，為使顏色更澄清，采用濾芯膜為0.22 μm精密膜過(guò)濾器精濾得米酒樣品JL。工藝流程如下：

1.3.2 樣品總DNA提取

將酒曲用研缽粉碎，用五分法取3 份平行樣品，分別編號(hào)JQ1、JQ2、JQ3；每種形式米酒分別取兩份平行，粗濾形式米酒編號(hào)為CL1、CL2，精濾形式米酒編號(hào)為JL1、JL2。分別稱取酒曲和2 種形式米酒樣品各200 mg，分別用DNA提取試劑盒和強(qiáng)力土壤?DNA提取試劑盒對(duì)樣品中細(xì)菌、真菌DNA進(jìn)行提取，提取方案按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3可變區(qū)和真菌的ITS1可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，具體引物見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌、真菌的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)Table1 1 Primers used for PCR amplification of bacterial 16S rDNA V3 variable region and fungal ITS1 variable region

細(xì)菌PCR體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，DNA模板 2 μL，Taq酶0.25 μL，引物338F 2 μL，引物518R 2 μL，用dd H2O補(bǔ)至50 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min（30 次循環(huán)），最后72 ℃延伸10 min。

真菌巢式第1輪P C R體系（5 0 μ L）：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.25 μL，引物ITS1F 2 μL，引物ITS2 2 μL，用dd H2O補(bǔ)至50 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min（35 次循環(huán)），最后72 ℃保溫10 min。真菌巢式第2輪PCR體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，DNA模板36.75 μL，Taq酶1 μL，引物ITS1F 2 μL，引物ITS2 2 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（5 次循環(huán)），最后72 ℃保溫10 min。

PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP208）PCR純化產(chǎn)物，建庫(kù)并于Illumina MiSeq和Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)上機(jī)分別對(duì)樣品中的細(xì)菌和真菌序列測(cè)序，測(cè)序工作委托北京理化分析測(cè)試中心完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode將下機(jī)數(shù)據(jù)，拆分成不同樣品，去除Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列。使用FLASH（version 1.2.7）軟件，通過(guò)Overlap對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags），再使用Trimmomatic （version 0.33）軟件，對(duì)原始Tags數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags），最后使用UCHME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。

將最終有效數(shù)據(jù)用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUS在97%的相似度水平下進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，利用Mothur（version v.1.30）軟件對(duì)樣品的α-多樣性進(jìn)行評(píng)估，并基于細(xì)菌Silva和真菌UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用Excel和Origin分別繪制樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖、主成分分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-多樣性分析

α-多樣性反映了單個(gè)樣品內(nèi)部物種的多樣性，根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用α-多樣性指標(biāo)的覆蓋率、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)對(duì)樣品微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。

表2 α-多樣性指數(shù)Table 2 Microbial α-diversity index of samples

每個(gè)樣品的覆蓋率、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)分別用于評(píng)估物種的測(cè)序深度、豐度和多樣性。覆蓋率反映了樣本的真實(shí)情況，該指數(shù)越高，則樣本中序列未被測(cè)出的概率越低；Chao指數(shù)是群落豐度指數(shù)，Chao指數(shù)越大，表明樣品微生物群落豐度越高；Shannon指數(shù)是群落分布多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)越大，表明樣品微生物多樣性越高；OTU數(shù)量亦可以代表樣品物種的豐度。由表2可知，酒曲與2 種形式米酒中微生物覆蓋率都大于0.9，說(shuō)明樣品文庫(kù)中序列基本上都被測(cè)出，即樣本測(cè)序結(jié)果可以反映樣品的真實(shí)情況。就細(xì)菌而言，酒曲樣品中細(xì)菌平均Chao指數(shù)與米酒樣品差異不大，但酒曲樣品中OTU數(shù)量明顯高于2 種米酒樣品，說(shuō)明酒曲中細(xì)菌群落豐度比米酒高。酒曲樣品中細(xì)菌Shannon指數(shù)也明顯高于2 種米酒樣品，說(shuō)明酒曲中細(xì)菌群落多樣性高于粗濾和精濾米酒，同時(shí)精濾米酒中細(xì)菌群落多樣性較粗濾米酒略有降低。就真菌而言，根據(jù)Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)可知，酒曲樣品中真菌群落豐度低于2 種米酒，而多樣性高于2 種米酒；同時(shí)，精濾米酒中真菌群落多樣性明顯低于粗濾米酒。

從α-多樣性指數(shù)可以得出，酒曲和米酒樣品中細(xì)菌物種豐度顯著高于真菌，但在米酒產(chǎn)品中，真菌豐度大幅增加，可能是由于發(fā)酵后的米酒中的優(yōu)勢(shì)菌群為霉菌和酵母；米酒的精濾工藝對(duì)微生物群落均有一定影響，但對(duì)真菌微生物群落影響較明顯，可能是由于真菌形態(tài)較大，易被過(guò)濾掉。

2.2 酒曲與米酒間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

圖1 門(mén)水平下酒曲與米酒樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 1 Distribution of bacterial communities in the starter culture and rice wines at the phylum level

在門(mén)水平下，酒曲和米酒樣品一共鑒定出25 個(gè)細(xì)菌物種，圖1顯示豐度水平前14的物種，其他物種合并為others。由圖1可知，酒曲中主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為：平均相對(duì)豐度為37.68%的變形菌門(mén)（Proteobacteria）、4.58%的厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、4.28%的藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria）和4.20%的放線菌門(mén)（Actinobacteria）；2 種米酒樣品中細(xì)菌主要優(yōu)勢(shì)菌群與酒曲相同，但是相對(duì)豐度差異較大，即粗濾米酒這4 種菌門(mén)的平均相對(duì)豐度分別為18.14%、21.17%、5.15%、1.24%，精濾米酒平均相對(duì)豐度分別為13.26%、23.28%、4.37%、1.08%。說(shuō)明在門(mén)水平下，酒曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與2 種米酒相同，僅組成比例存在一定差異，而2 種形式米酒間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及其比例均相似，即精濾工藝對(duì)米酒中門(mén)水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。在酒曲樣品中，變形菌門(mén)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，而2 種米酒的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(mén)，這可能是由于變形菌門(mén)的一部分細(xì)菌為好氧型，不能適應(yīng)米酒發(fā)酵過(guò)程中缺氧、產(chǎn)酸、產(chǎn)醇的環(huán)境，因而豐度降低；而厚壁菌門(mén)中的乳桿菌和乳球菌大多數(shù)為厭氧細(xì)菌，能夠產(chǎn)酸且在高酸環(huán)境下生長(zhǎng)[11]，因而其豐度在米酒產(chǎn)品中增加。本研究酒曲中藍(lán)藻菌門(mén)平均相對(duì)豐度為4.28%，可能來(lái)源酒曲原料中植物中的葉綠體。

圖2 屬水平下酒曲與米酒樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 2 Distribution of bacterial communities in the starter culture and rice wines at the genus level

在屬水平下，酒曲和米酒樣品中一共檢測(cè)出147 個(gè)細(xì)菌物種，圖2顯示豐度前17的物種，其他物種合并為others。由圖2可知，酒曲中主要細(xì)菌分別為平均豐度5.00%的假單胞菌屬（Pseudomonas）、4.28%的腸桿菌屬（Enterobacter）、1.21%的魏斯氏菌屬（Weissella）、1.11%的棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、0.53%的歐文氏菌屬（Erwinia）和0.47%的不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。2 種米酒中主要細(xì)菌均為乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬、片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬、球菌屬（Tetragenococcus）、棒狀桿菌屬，其中粗濾米酒中這7 類菌群的平均相對(duì)豐度分別為3.72%、6.31%、3.38%、3.44%、2.25%、1.39%、0.68%，精濾米酒中相對(duì)豐度為7.73%、4.41%、3.73%、1.66%、2.71%、1.08%、0.90%。說(shuō)明酒曲與米酒樣品中屬水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大；而2 種米酒間細(xì)菌菌群組成相似，只是豐度有所差異。腸桿菌屬和假單胞菌屬是酒曲樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群，而隸屬于乳酸菌的乳桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌在米酒樣品中大幅增加，成為米酒樣品的優(yōu)勢(shì)菌。這與韓國(guó)米酒中發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬細(xì)菌在米酒發(fā)酵階段逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌結(jié)果一致[12]。乳酸菌在米酒發(fā)酵過(guò)程中能利用發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸等，降低米酒中的pH值，并且乳酸與乙醇發(fā)生反應(yīng)生成酯類是米酒重要的風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)乳酸菌代謝過(guò)程中產(chǎn)生乙酰和雙乙酰，賦予米酒特色風(fēng)味[13-14]。另外乳酸菌能生成具有抗菌作用的細(xì)菌素[15]，這對(duì)抑制米酒中致病、致腐菌具有重要意義。腸桿菌屬一般為非條件致病菌或條件致病菌，部分為人體腸道內(nèi)正常微生物，能利用糖酵解和戊糖磷酸途徑對(duì)糖進(jìn)行降解產(chǎn)生有機(jī)酸[16]，該屬細(xì)菌在酒曲和精濾米酒樣品中豐度差異不大，但在粗濾米酒中豐度增加。而假單胞菌屬多為條件致病菌，且為嚴(yán)格好氧菌[17]，該屬細(xì)菌幾乎不能在酸性、缺氧的條件下生長(zhǎng)，因而在米酒產(chǎn)品中比例大幅下降。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究朝鮮族米酒及其酒曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，酒曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為假單胞菌屬和腸桿菌屬，其米酒中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為乳桿菌屬、腸桿菌屬。Lü Xucong等[18]用PCR-DGGE對(duì)紅曲糯米酒的酒曲微生物群落進(jìn)行分析，表明其主要細(xì)菌為芽孢桿菌和乳酸菌，如人參土芽孢桿菌（Bacillus ginsengihumi）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。Song等[3]收集韓國(guó)各地區(qū)42 份Nuruk酒曲分析微生物群落，發(fā)現(xiàn)在所有的酒曲中主要的優(yōu)勢(shì)菌是芽孢桿菌屬（Bacillus），如解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。芽孢桿菌屬具有很高的α-淀粉酶和糖化酶活性[19]，對(duì)米酒糖化有利，而本研究不論是在酒曲中還是在米酒中，都未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌。可能是由于酒曲原料和制作工藝的不同，導(dǎo)致了酒曲中微生物群落結(jié)構(gòu)有所不同。Cai Haiying等[20]研究孝感米酒微生物群落發(fā)現(xiàn)，其主要優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬，其中乳桿菌屬也是本研究2 種朝鮮族米酒中的優(yōu)勢(shì)菌。本研究在米酒和酒曲中發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬，該類菌屬中有一部分細(xì)菌產(chǎn)酸，在米酒發(fā)酵過(guò)程中，乳桿菌屬和腸桿菌屬可能會(huì)共同產(chǎn)酸，因而導(dǎo)致了朝鮮族米酒酸味口感突出。

2.3 酒曲與米酒間真菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

圖3 門(mén)水平下酒曲與米酒樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 3 Distribution of fungal communities in the starter culture and rice wines at the phylum level

在門(mén)水平下，從酒曲和米酒樣品中一共鑒定出5 個(gè)真菌物種，但酒曲中有0.16%、米酒中有1.12%為未被鑒定出物種和酒曲中0.06%、米酒中0.15%比例為未知物種。由圖3可知，酒曲和米酒門(mén)水平下真菌群落均主要是子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、毛霉亞門(mén)（Mucoromycota）。酒曲和米酒中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群均為子囊菌門(mén)，二者中的相對(duì)平均豐度分別為85.9%、98%。子囊菌門(mén)的真菌群落在米酒產(chǎn)品中豐度大幅增加并占有絕對(duì)主導(dǎo)，說(shuō)明其在米酒發(fā)酵中起重要作用。而擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度由酒曲中15.31%降低至米酒中0.18%，表明擔(dān)子菌門(mén)真菌群落可能在低氧、酸性、高醇的環(huán)境下難以生存。毛霉亞門(mén)真菌群落的相對(duì)豐度由酒曲中2.3%增加至粗濾米酒中5.3%，而在精濾米酒中顯著降低至0.7%，這可能是由于毛霉在米酒發(fā)酵過(guò)程中有一定的糖化力[21]，而又由于毛霉菌絲體較大，不能通過(guò)精濾設(shè)備的0.22 μm的篩孔，因此，粗濾米酒中其豐度增加，而精濾米酒中降低。

圖4 屬水平下酒曲與米酒樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 4 Distribution of fungal communities in the starter culture and rice wines at the genus level

在屬水平下，從酒曲和米酒中一共鑒定出12 個(gè)真菌物種，圖4顯示豐度前10的物種，但酒曲中有1.28%、米酒中有5.23%為未被鑒定出物種和酒曲中5.88%、米酒中20.85%為未知物種。如圖4所示，酒曲中真菌群落與米酒中存在較大差異，米酒間真菌群落組成相似，但豐度有所差異。酒曲中優(yōu)勢(shì)菌屬是青霉菌屬（Penicillium）和蘭久浩酵母屬（Guehomyces），平均相對(duì)豐度分別為49.45%、10.28%；粗濾米酒樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬為酵母屬（Saccharomyces）和絲孢畢赤氏酵母屬（Hyphopichia），相對(duì)豐度分別為50.93%、30.15%；精濾米酒中，真菌群落比例發(fā)生一定變化，優(yōu)勢(shì)菌屬亦為酵母屬和絲孢畢赤酵母屬，豐度分別增至84.12%、降至6.47%。青霉具有很強(qiáng)產(chǎn)葡萄糖淀粉酶能力，對(duì)大米淀粉具有重要水解作用[22]，但隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，米酒體系中有機(jī)酸和醇不斷積累，破壞青霉的生長(zhǎng)環(huán)境，因而其比例在米酒樣品中大幅降低。目前，在其他酒曲和米酒中較少發(fā)現(xiàn)有報(bào)道蘭久浩酵母屬，Bhadra等[23]研究發(fā)現(xiàn)蘭久浩酵母屬能夠在用于乙醇發(fā)酵的含糖基質(zhì)上生長(zhǎng)。酵母屬具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力、高產(chǎn)乙醇能力，乙醇耐受性強(qiáng)，是白酒釀造過(guò)程中最主要的功能菌株[24-25]，因此其含量在米酒樣品中持續(xù)增加，一躍成為米酒中的優(yōu)勢(shì)菌。絲孢畢赤酵母屬是發(fā)酵飲料中常見(jiàn)的產(chǎn)香酵母，對(duì)米酒有增香作用[26]，但有可能該類酵母菌體大，不能通過(guò)0.22 μm篩孔的精濾設(shè)備，因而其比例在粗濾米酒中增加，精濾米酒中降低。

圖5 種水平下酒曲與米酒樣品真菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig. 5 Distribution of fungal communities in the starter culture and rice wines at the species level

在種水平下，酒曲和米酒中一共鑒定出12 個(gè)物種，圖5顯示豐度前10的物種，但酒曲中有0.99%、米酒中有3.01%比例合并為others，酒曲中10.52%、米酒中78.21%比例為未知物種。由圖5可知，酒曲中主要真菌為：平均相對(duì)豐度為10.22%的普魯蘭久浩酵母（Guehomyces pullulans）、3.41%的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、1.56%的枝孢霉（Cladosporium delicatulum）、1.16%總狀毛霉（Mucor racemosus）、1.15%波蘭青霉（Penicillium polonicum）等。普魯蘭久浩酵母屬于耐冷酵母，在低溫下有高活性，是一種能高產(chǎn)乳糖酶的菌株[27]，目前在東北的酸湯子玉米面團(tuán)[28]和黏豆包[29]中有發(fā)現(xiàn)，因此，可以推斷出該菌株為東北地區(qū)特色菌種；并有研究表明普魯蘭久浩酵母能夠在用于乙醇發(fā)酵的含糖基質(zhì)上生長(zhǎng)，說(shuō)明普魯蘭久浩酵母在米酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)醇[23]。異常威克漢姆酵母是一種產(chǎn)香酵母，具有較高的產(chǎn)3-甲基-1-丁醇能力[30]，對(duì)米酒的風(fēng)味有很好的貢獻(xiàn)作用。另外，枝孢霉是一種植物中的內(nèi)生真菌，推測(cè)可能來(lái)源于制作酒曲的各種植物原料中；總狀毛霉具有產(chǎn)淀粉酶和脂肪酶的能力[31]，對(duì)糖化有利；波蘭青霉通常在谷物、玉米、肉制品中都存在，本酒曲中的波蘭青霉可能來(lái)源于酒曲原料的發(fā)芽玉米粉和糯米粉。米酒中主要真菌為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）、異常威克漢姆酵母、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和少根根霉（Rhizopus arrhizus）等。其中，粗濾米酒中釀酒酵母平均相對(duì)豐度為49.48%、伯頓絲孢畢赤酵母為29.47%，精濾米酒中其相對(duì)豐度分別為81.52%、6.43%。釀酒酵母是釀酒過(guò)程主要的功能菌株[25,32]，有很強(qiáng)的發(fā)酵能力，高產(chǎn)乙醇，因此在米酒中比例持續(xù)增加；伯頓絲孢畢赤酵母是釀酒過(guò)程中的產(chǎn)香酵母，具有較強(qiáng)的產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異戊酯和苯乙醇能力[24]，能夠賦予米酒濃郁的花香味。此外，卷枝毛霉在我國(guó)甜酒曲以及韓國(guó)酒曲Nuruk中均有發(fā)現(xiàn)[3,33]，其可以在菌絲內(nèi)積累大量具有治療心血管疾病、降低膽固醇等功能的脂肪酸[34]。米酒中扣囊復(fù)膜酵母也是產(chǎn)香酵母，具有良好的產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯等風(fēng)味物質(zhì)能力[26]，能夠賦予米酒果香味；少根根霉具有較高的淀粉酶活力，并能產(chǎn)生脂肪酶[35]，能夠有效地分解大米中淀粉和脂肪。

研究朝鮮族米酒及其酒曲中微生物群落發(fā)現(xiàn)，酒曲中優(yōu)勢(shì)菌主要為青霉菌屬和蘭久浩酵母屬，其米酒中優(yōu)勢(shì)菌主要為酵母屬和絲孢畢赤氏酵母屬。與本研究不同，Ponnusamy等[36]研究韓國(guó)米酒Nuruk酒曲制備過(guò)程中微生物群落，表明米曲霉（Aspergillus oryzae）是其主要真菌。Park等[37]報(bào)道，紅曲米酒發(fā)酵前期主要優(yōu)勢(shì)菌為米根霉（Rhizopus Oryzae）、季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii），后期為釀酒酵母，該結(jié)果與本研究結(jié)果類似，說(shuō)明在米酒發(fā)酵后期，釀酒酵母是優(yōu)勢(shì)菌，且在產(chǎn)品中起著至關(guān)重要的作用。而研究孝感米酒中真菌群落發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢(shì)菌主要為根霉菌屬（Rhizopus）、曲霉菌屬（Aspergillus）、酵母屬[20]；與之不同，本研究的朝鮮族米酒中少量存在根霉菌屬，不存在曲霉菌屬。Lü Xucong等[38]從10 份紅曲米酒酒曲中分離鑒定絲狀真菌，發(fā)現(xiàn)米根霉、米曲霉、黃曲霉（Aspergillus flavus）很強(qiáng)的α-淀粉酶或糖化酶活性，這表明曲霉屬和根霉屬在米酒發(fā)酵過(guò)程中能夠有效地分解淀粉，增加小分子糖的含量，因而使米酒含糖量高且口感偏甜。而朝鮮族米酒中根霉含量少，曲霉不存在，使米酒在發(fā)酵過(guò)程中淀粉降解程度偏低，因而酸味口感突出。

2.4 酒曲與米酒間微生物群落相似性分析

主成分分析可以直觀地將樣品間相似或差異程度體現(xiàn)在二維坐標(biāo)圖上，距離越近則表示越相似。如圖6所示，主成分1和主成分2分別解釋了酒曲與米酒樣品中細(xì)菌群落95.61%和3.83%的信息，兩主成分之和大于80%，則表明兩個(gè)成分較好地代表了樣品中的細(xì)菌群落信息。3 份酒曲平行樣品距離米酒樣品有一定距離，說(shuō)明酒曲中細(xì)菌群落與米酒有一定差異；相比之下，2 種米酒間樣品距離較近，差異不大，說(shuō)明米酒間的細(xì)菌群落相似性高，這與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析一致。由圖7可知，真菌群落主成分析的兩個(gè)主成分分別解釋了酒曲與米酒中真菌群落90.81%和7.47%的信息，也較好地代表了樣品中真菌群落信息，說(shuō)明酒曲中真菌群落與米酒樣品中存在一定差異，米酒間真菌群落相似性要低于細(xì)菌群落，說(shuō)明精濾工藝對(duì)米酒中真菌群落影響較大。

圖6 酒曲與米酒樣品中細(xì)菌群落主成分分析圖Fig. 6 Principal coordinate analysis of bacterial communities in the starter culture and rice wines

圖7 酒曲與米酒樣品真菌群落主成分分析圖Fig. 7 Principal coordinate analysis of fungal communities in the starter culture and rice wines

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)朝鮮族傳統(tǒng)米酒及其酒曲中微生物多樣性進(jìn)行分析，對(duì)其中優(yōu)勢(shì)菌群組成進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，朝鮮族米酒中主要優(yōu)勢(shì)菌為乳桿菌屬、腸桿菌屬、酵母屬和絲孢畢赤氏酵母屬；而酒曲中主要優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬、腸桿菌屬、青霉菌屬和蘭久浩酵母屬，這表明，朝鮮族米酒與其他種類米酒及其酒曲中微生物菌群存在顯著差異。研究還表明，精濾工藝對(duì)米酒的微生物群落結(jié)構(gòu)影響不大，但對(duì)微生物豐度有一定的影響。該結(jié)果能夠?yàn)槿蘸笊钊胙芯砍r族米酒及酒曲微生物提供借鑒與參考，也能為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)品質(zhì)安全、風(fēng)味優(yōu)良的朝鮮族米酒提供理論支持。