烏龍茶加工過程中兒茶素的穩(wěn)定性及化學變化

劉洪林，曾藝濤，趙 欣,*

（1.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，功能性食品研發(fā)重慶市工程實驗室，重慶 400067；2.重慶市輔仁中學校，重慶 400067）

中國的6 大茶類均含有大量的多酚類化合物，因發(fā)酵程度不同而存在于不同的化合物中。綠茶中含有大量未氧化的兒茶素包括(－)-兒茶素（gallocatechin，GC）、(－)-表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、(＋)-兒茶素（catechin，C）、(－)-表兒茶素（epicatechin，EC）、(－)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，GCG）、(－)-表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）和(－)-兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）；兒茶素的氧化衍生物茶黃素（theaflavins，TFs）和茶紅素（thearubigins，TRs）存在于部分發(fā)酵茶（烏龍茶、黃茶和白茶）、全發(fā)酵茶（紅茶）和后發(fā)酵茶（黑茶）中[1-3]。6 大茶類中綠茶兒茶素的含量是最高的，而紅茶、黑茶等因其氧化時間較長而大大減少。兒茶素是主要的活性成分，綠茶中占干質(zhì)量的25%。

由于茶中多酚類化合物的健康益處，各制造商試圖生產(chǎn)出多酚含量高的茶葉產(chǎn)品。然而，茶葉生產(chǎn)中多酚的含量和穩(wěn)定性取決于多種因素，如品種、收獲季節(jié)、植物的年齡、氣候、環(huán)境條件和加工條件[4]。在這些因素中，加工條件是決定茶葉產(chǎn)品質(zhì)量的最重要因素之一。目前，研究加工對茶葉多酚含量的影響，主要集中在綠茶中[5-10]和紅茶[11-13]，很少有研究關(guān)注烏龍茶[14-15]。這可能是因為全世界人們飲用最多的茶類是紅茶（78%），其次是綠茶（20%），而烏龍茶在世界范圍內(nèi)的消費量僅為2%。現(xiàn)如今，烏龍茶在世界上越來越受歡迎，但與對綠茶和紅茶中活性成分的積極研究相比，對烏龍茶的研究卻少得多。

烏龍茶中兒茶素有EC、EGC、ECG、EGCG、C、GC、CG、GCG，化學結(jié)構(gòu)如圖1所示。這些兒茶素在茶葉中含量高，對健康有益[16-17]。兒茶素的鑒定與測定一直是烏龍茶化學控制的重點[9,18-19]，因此，茶葉生產(chǎn)商試圖生產(chǎn)高兒茶素含量的烏龍茶，以應(yīng)對日益增長的功能性食品市場。然而，兒茶素的含量和穩(wěn)定性取決于加工過程中的多種因素[6,9,20]。

烏龍茶中兒茶素在加工過程中會發(fā)生化學變化，如差向異構(gòu)化作用和降解反應(yīng)[21-22]，這些反應(yīng)會導致現(xiàn)在的商業(yè)茶飲兒茶素含量略有下降。因此，對兒茶素在加工和貯存過程后在飲茶水溶液中的穩(wěn)定性進行了大量研究[23-24]，但在烏龍茶加工過程中的研究卻鮮見報道。特別是在剛開始的鮮葉采摘、烏龍茶嚴格由同一位專家控制的情況下加工過程中關(guān)于兒茶素變化的相關(guān)研究更為鮮見。要生產(chǎn)高品質(zhì)的烏龍茶，高含量的兒茶素是因素之一，故了解烏龍茶加工過程中酚類化合物的穩(wěn)定性，以獲得最佳的健康效益非常重要。因此，本實驗研究加工過程中烏龍茶中兒茶素的變化，評價每道加工工藝對烏龍茶生產(chǎn)中兒茶素變化的影響，以期為烏龍茶加工技術(shù)提供一定的參考數(shù)據(jù)，為茶葉產(chǎn)業(yè)提供酚類化合物的確切信息。

圖1 兒茶素、咖啡因和沒食子酸的化學結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of catechins, caffeine and gallic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品：包括GC（≥98%）、EGC（≥98%）、C（≥98%）、EC（≥90%）、EGCG（≥95%）、GCG（≥98%）、ECG（≥98%）、CG（≥98%） 美國Sigma-Aldrich公司；Folin-Ciocalteu試劑、乙腈、三氟乙酸、甲醇（均為色譜純） 瑞士Fluka公司；無水碳酸鈉德國默克公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Whatman No.4濾紙 美國Whatman有限公司；0.45 μm聚四氟乙烯過濾器 美國貝德福德微孔有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Aglient公司；Platinum EPS C18液相色譜柱（53 mm×7 mm，3 μm） 美國Whatman公司；DFT-200型200 g手提式粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；FA2004A型分析天平 海津天電子儀器有限公司；Mili-Q超純水儀 美國密理博公司；Centrifuge5810高速離心機 德國Eppendorf公司；TU 1900型雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 烏龍茶加工

在福建武夷山采取同一地點生長的12 個品種的一芽二葉采取烏龍茶加工工藝對茶葉進行加工。實驗開始前對烏龍茶的加工工藝進行了調(diào)查，將每個品種采摘的鮮葉分成3 組，然后加工成烏龍茶（發(fā)酵程度約為10%～20%）。采摘、萎凋、做青、殺青、揉捻、烘焙每個加工工藝步驟后采集茶葉樣本（250 g），每一道工藝抽取3 個樣本。分析之前立即用聚丙烯塑料袋真空包裝和－20 ℃貯存樣本大約3～5 d，備用。

1.3.2 樣本提取

由于從各加工工藝收集的茶葉樣本水分含量不同，因此稱取樣本的質(zhì)量不同。對采摘后的鮮葉、萎凋、做青、殺青、揉捻、烘焙步驟分別稱量茶樣10、10、10、5、2 g和2 g（精確到0.001 g）。茶葉樣本細磨成粉和200 mL 80 ℃蒸餾水用攪拌機或均質(zhì)器提取15 min，提取的混合物（渣用蒸餾水洗凈（3×10 mL））通過濾紙（Whatman No. 4）過濾，將過濾后的茶湯冷卻至室溫，用蒸餾水調(diào)至250 mL。所有樣品均為一式3 份，備用。

1.3.3 各兒茶素單體、TCC測定

采用ISO方法[25]對各兒茶素單體、兒茶素總量（TCC，8 種兒茶素單體的總和）進行測定，并進行細微修改。GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG標準曲線制定：將標準品用甲醇溶解并定容至1 000 μg/mL的標準母液，混合標準母液是通過混合每個標準母液的等量體積制備。制作標準曲線的稀釋混合標準品和樣品（蒸餾水稀釋10 倍）透過0.45 μm聚四氟乙烯過濾器過濾并進行HPLC分析。利用Platinum EPS C18反相色譜柱（53 mm×7 mm，3 μm），柱溫30 ℃。流動相A為含體積分數(shù)0.05%三氟乙酸溶液，B相為乙腈溶液，A、B相體積比為87∶13，流速2 mL/min。進樣量20 μL，檢測波長為210 nm。用標準曲線對各兒茶素單體進行量化，計算質(zhì)量分數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)表示為 ±s。利用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析

利用AOAC國際指南對膳食補充劑和植物制劑的化學方法進行單實驗室驗證[26]方法HPLC結(jié)果驗證。通過比較在190～400 nm紫外光譜標準范圍內(nèi)的的保留時間鑒別兒茶素、沒食子酸和咖啡因。校準曲線的繪制是用9 種水平構(gòu)成的，覆蓋了茶葉樣品預(yù)期的質(zhì)量濃度范圍。由表1得知，GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG的線性檢測范圍質(zhì)量濃度分別為0.10～51.9、0.09～43.1、0.20～100.0、0.19～97.0、0.16～80.0、0.11～52.9、0.20～98.0、0.09～44.1 μg/mL。所有分析物相關(guān)系數(shù)R2范圍為0.996 5～0.999 9，均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表1 8 種兒茶素單體測定的線性相關(guān)性Table 1 Linear equations for 8 individual catechins

圖2 標準品（A）、鮮葉（B）和烏龍茶（C）的HPLC圖Fig. 2 Typical chromatograms of standard compounds (A), fresh tea shoots (B) and Oolong tea from drying step (C)

如圖2所示，烏龍茶加工開始和結(jié)束之間的HPLC圖存在差異。在鮮葉中檢測到7 個兒茶素單體，通過與標準品比較保留時間和真實值，從左到右被鑒定為GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG，未檢出CG。將HPLC峰面積與標準品進行比較，對GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG進行量化。發(fā)現(xiàn)鮮葉中兒茶素含量中，EGCG質(zhì)量分數(shù)最高，為（4.94±0.28）%；其次是EC質(zhì)量分數(shù)為（1.92±0.14）%；EGC質(zhì)量分數(shù)為（1.90±0.24）%，C質(zhì)量分數(shù)為（1.66±0.17）%，ECG質(zhì)量分數(shù)為（1.16±0.08）%；微量的GC質(zhì)量分數(shù)為（0.37±0.04）%，GCG質(zhì)量分數(shù)為（0.26±0.03）%。根據(jù)兒茶素單體質(zhì)量分數(shù)得到兒茶素總量為（12.25±0.17）%。這些結(jié)果與之前報道一致[27-29]，然而，研究發(fā)現(xiàn)個別品種酚類化合物的含量存在差異。這可能是由于化合物的種類和含量受到許多因素的影響，包括子品種和品種種類、生長環(huán)境的要素和采收條件等[27-29]。

2.2 TCC和兒茶素單體含量的變化

表2 茶葉中TCC和兒茶素單體的含量Table 2 Contents of total catechins and individual catechins in tea samples from each processing step%

如表2所示，鮮葉中TCC為（12.25±0.17）%。在加工過程中，TCC含量在萎凋過程中保持不變。做青加工過程中TCC大大減少，質(zhì)量分數(shù)為（10.05±0.36）%；殺青過程中含量又略有增加，是由于兒茶素單體EGC、GC和GCG含量的增加導致；干燥后，TCC為（11.06±0.45）%，大約是鮮葉中的90%。

兒茶素含有兩個芳香環(huán)和幾個羥基，可分為兩類：游離兒茶素和酯型兒茶素。C、EC、GC和EGC為非酯型，而酯型兒茶素為CG、ECG、GCG和EGCG。此外，兒茶素可根據(jù)其立體化學構(gòu)型分為“非表兒茶素或非表兒茶素結(jié)構(gòu)”（如C、CG、GC、GCG）和“表兒茶素或表兒茶素結(jié)構(gòu)”（包括EC、ECG、EGC、EGCG）。表兒茶素可以轉(zhuǎn)化為非表兒茶素GC、GCG、CG和C，這被稱為兒茶素的異構(gòu)化，兒茶素的異構(gòu)化是可逆的。表兒茶素和非表兒茶素的化學結(jié)構(gòu)中僅在2R、3R（2,3-cis、表兒茶素結(jié)構(gòu)）和2S、3R（2,3-trans，非表兒茶素結(jié)構(gòu)）之間存在差異[30-31]。

C的結(jié)構(gòu)與EC相似，但與EC不同的是它有2S、3R結(jié)構(gòu)（2,3-trans，非表兒茶素結(jié)構(gòu)），而EC有2R、3R結(jié)構(gòu)（2,3-cis、表兒茶素結(jié)構(gòu)）[32]。鮮葉中EC和C質(zhì)量分數(shù)分別為（1.92±0.14）%和（1.66±0.17）%。在萎凋的步驟質(zhì)量分數(shù)保持不變，干燥步驟后分別穩(wěn)步下降到（0.84±0.11）%和（0.95±0.17）%。EC和C含量的做青和干燥步驟均有明顯的下降，EC含量分別下降為鮮葉含量的81%和43%，C含量分別下降為鮮葉含量的89%和57%。

EGC和EC具有相似的結(jié)構(gòu)，但EGC與EC的不同之處在于其碳3’,4’,5’在B環(huán)上。GC具有與EGC相同的結(jié)構(gòu)，但與EGC不同的是它有2S、3R（2,3-trans，非表兒茶素結(jié)構(gòu)），而EGC有2R、3R（2,3-cis、表兒茶素結(jié)構(gòu)）[32]。研究結(jié)果表明，鮮葉中EGC質(zhì)量分數(shù)為（1.90±0.24）%。EGC含量在萎凋中保持恒定，在做青階段顯著降低，在殺青過程中顯著增加，在干燥過程中顯著增加。做青步驟EGC含量減少到約為鮮葉中的81%，這可能是因為在部分發(fā)酵過程中酶的氧化作用。而兩個熱加工過程（殺青和干燥步驟）顯著增加了EGC含量，在熱加工過程中EGC的增加可能是由于EGCG的熱降解。EGCG可能降低，導致EGC的形成和游離態(tài)G的釋放。鮮葉中GC只含微量，為（0.37±0.04）%。加工過程中GC含量的變化和其表位結(jié)構(gòu)EGC一致。許多研究表明，兒茶素在茶葉生產(chǎn)、釀造和貯存過程中轉(zhuǎn)化為其異構(gòu)體，在高溫環(huán)境下會發(fā)生異構(gòu)化[30]。研究表明，兒茶素在熱水溶液中處于C2位置時發(fā)生表面聚合，這種外顯作用可使表兒茶素變?yōu)榉潜斫Y(jié)構(gòu)兒茶素，反之亦然[30,33-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，GC含量的增加，可能是熱加工過程中EGC的異構(gòu)化導致GC含量增加。

ECG與EC具有相似的結(jié)構(gòu)，但ECG在碳環(huán)C3處的沒食子結(jié)構(gòu)不同。CG與ECG結(jié)構(gòu)相同，但與EGC不同的是，它有2S、3R（2,3-trans，非表兒茶素結(jié)構(gòu)），而ECG有2R、3R（2,3-cis表兒茶素結(jié)構(gòu)）[32]。鮮葉和烏龍茶中ECG質(zhì)量分數(shù)分別為（1.16±0.08）%、（0.71±0.04）%。單因素方差分析表明，ECG在做青過程首次略有下降，質(zhì)量分數(shù)為（1.02±0.29）%；殺青步驟后稍微增加，質(zhì)量分數(shù)為（1.19±0.45）%；在揉捻和干燥過程中均有明顯下降。結(jié)果表明，做青、揉捻和干燥步驟使ECG含量降低，分別約為鮮葉含量的88%、72%和61%。ECG含量波動的原因可能是加工過程中的許多因素和反應(yīng)。在做青過程中，ECG可能經(jīng)歷部分發(fā)酵導致ECG發(fā)生酶促氧化，形成二聚體或高度絡(luò)合的化合物群。在熱加工過程中，ECG可能會發(fā)生降解，導致游離態(tài)G的釋放。此外，ECG可能是由EGCG的熱降解形成。本研究未在鮮葉中檢測到CG，ECG上的異構(gòu)化作用不能增加CG含量，說明異構(gòu)化作用可能不會導致ECG的下降。因此，可以合理地得出結(jié)論，在烏龍茶加工過程中，茶葉中的ECG變化相當復雜，但這種變化并非來自異構(gòu)化作用。

EGCG具有與EGC相似的結(jié)構(gòu)，但EGCG與EGC不同的是，在C環(huán)碳3上的EGCG的沒食子酸酯部分與EGC不同。GCG與EGCG具有相同的結(jié)構(gòu)，但與EGCG不同的是，EGCG有一個2S、3R（2,3-trans、非表兒茶素結(jié)構(gòu)），而EGCG有2R、3R（2,3-cis、表兒茶素結(jié)構(gòu)）[32]。EGCG是鮮葉中含量最多的的酯型兒茶素，質(zhì)量分數(shù)為（4.94±0.28）%。在加工過程中，EGCG含量在做青過程中顯著降低，并一直保持恒定，直至揉捻為止，干燥過程中其含量再次顯著降低。結(jié)果表明，做青和干燥步驟顯著影響EGCG含量，分別使其下降為鮮葉中含量的80%和61%。可以得知，烏龍茶的加工對EGCG的穩(wěn)定性有很大影響，可能是EGCG在做青過程中，在濕度充足的環(huán)境下非常敏感發(fā)生了氧化作用。在做青過程中，EGCG損失的另一個原因可能是酶氧化，形成二聚兒茶酚和復合酚類化合物。在熱加工過程中，EGCG損失的主要原因可能是在干燥的過程中，在極高溫度下，會發(fā)生異構(gòu)化和降解作用。這與之前報道的EGCG化學特征的理論理解是一致的[36]。EGCG是一種酯型多酚化合物，在這種條件下，EGCG可氧化成二聚體，降解成EGC和異構(gòu)化作用成GCG[30,34-35]。

GCG在鮮葉中微量，質(zhì)量分數(shù)為（0.26±0.03）%。在做青時，GCG顯著降低，在殺青階段則又顯著增加，在干燥過程中，它再次顯著增加，干燥步驟之后，GCG質(zhì)量分數(shù)增加到（0.95±0.06）%，變化趨勢與EGCG相同。

2.3 加工工藝對酚類化合物含量變化的影響

鮮葉采摘后，在陽光直射下萎凋。與鮮葉相比，凋萎步驟中茶葉兒茶素的含量保持不變，這表明萎凋步驟不影響兒茶素的含量。研究表明，此步驟僅用于鮮葉中去除水分和散發(fā)青草味。在做青過程中，TCC、EC、C、EGC、GC、ECG、EGCG、GCG含量均有所下降。導致兒茶素顯著減少的一個原因可能是酶促氧化，形成二聚兒茶素和復合酚化合物。

在殺青、揉捻和干燥加工過程中，兒茶素經(jīng)氧化、水解、聚合和轉(zhuǎn)化后，兒茶素含量降低。結(jié)果表明，殺青和烘干均能顯著提高EGC、GC、GCG的含量。從表1可以看出，烏龍茶中EGC、GC和GCG的含量比鮮葉中超過100%，這表明其他的兒茶素在殺青和干燥過程中會被轉(zhuǎn)化為EGC、GC和GCG。在熱加工過程中EGC的增加可能是由于EGCG的熱降解，導致EGC的形成和游離態(tài)G的釋放[30]。由于EGCG在熱加工過程中呈下降趨勢，EGCG的降解較為明顯。EGC和EGCG的異構(gòu)化作用可能會導致GC和GCG的增加，因為異構(gòu)化會在高溫下發(fā)生[30]，這種異構(gòu)化作用可使表兒茶素變?yōu)榉潜韮翰杷?。這一事實可以通過前面研究得到支持，研究發(fā)現(xiàn)，EGCG生成的GCG進一步轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物或自由基，甚至無法被檢測到[37]。雖然異構(gòu)化可以將表兒茶素轉(zhuǎn)化為非表兒茶素，反之亦然，但隨著EGCG含量的降低，GCG的含量升高，這可能是由于EGCG含量高于GCG，EGCG的轉(zhuǎn)化程度大于GCG。因此，EGCG含量與GCG含量趨于平衡，兒茶素的異構(gòu)化作用，尤其是EGCG，被認為是烏龍茶生產(chǎn)中最重要的反應(yīng)之一[30,33-35]。此外，導致兒茶素變化的其他原因可能是加工過程中可用的氧和金屬離子，高氧水平會增加兒茶素氧化，兒茶素能與金屬離子反應(yīng)形成金屬絡(luò)合物，且金屬離子優(yōu)先與ECG和EGCG的基團結(jié)合[38-39]。

3 結(jié) 論

結(jié)果表明，在烏龍茶生產(chǎn)過程中，兒茶素質(zhì)量分數(shù)略有下降，約為10%。兒茶素單體變化不一，其中EC質(zhì)量分數(shù)下降為鮮葉的43%，C質(zhì)量分數(shù)下降為鮮葉的57%，EGC質(zhì)量分數(shù)增加為鮮葉的1.67 倍，GC質(zhì)量分數(shù)增加為鮮葉的4 倍，ECG和EGCG質(zhì)量分數(shù)均降低約為鮮葉的61%，GCG質(zhì)量分數(shù)增加為鮮葉的3.65 倍。

在加工過程中，做青、殺青和干燥步驟對兒茶素含量有影響。兒茶素單體的變化可能是由于酶的氧化、熱降解和異構(gòu)化。由于人們越來越意識到茶葉中含有的生物活性多酚類化合物對健康的潛在益處，茶葉市場得到了廣泛的發(fā)展。因此，本研究的結(jié)果為茶葉產(chǎn)業(yè)提供了酚類化合物的確切信息。