溫度、pH值對(duì)離體模型中肌原纖維蛋白去磷酸化反應(yīng)的影響

任 馳，侯成立，李 欣，擺玉薔，張德權(quán)*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

肌原纖維蛋白占宰后肉中蛋白總量的55%～60%，是肌細(xì)胞骨架的重要組成部分，與肌肉收縮密切相關(guān)，影響宰后肉嫩度[1-2]。蛋白質(zhì)磷酸化修飾是最為普遍且重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[3-6]，在不同嫩度、色澤、pH值下降速率或基因型的宰后肉中鑒定到許多磷酸化蛋白質(zhì)[7-10]，肌原纖維蛋白存在磷酸化修飾現(xiàn)象[3]。蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)可逆，經(jīng)磷酸酶催化發(fā)生去磷酸化反應(yīng)。堿性磷酸酶是普遍存在的一種磷酸酶，可對(duì)底物分子起到去磷酸化作用[11-13]，在醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[14]。研究表明當(dāng)宰后肉中蛋白質(zhì)發(fā)生去磷酸化修飾后會(huì)正向影響嫩度、肉色等品質(zhì)[11,15]，通過控制堿性磷酸酶活性降低蛋白質(zhì)磷酸化水平是一種潛在的方法。酶活性主要受溫度和pH值影響，宰后肉在成熟過程中在不同溫度下加工、貯藏、運(yùn)輸、銷售，而且隨著成熟時(shí)間延長pH值會(huì)逐漸降低到極限pH值后略微回升。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)溫度及3 個(gè)pH值，分別為25（室溫）、15 ℃（車間溫度）和4 ℃（冷藏溫度），pH 5.2（極限pH值）、pH 5.8（介于極限pH值和pH45min的中間pH值）和pH 6.4（pH45min）。通過測定不同溫度和pH值條件下酶活性變化及肌原纖維蛋白磷酸化水平變化，明確堿性磷酸酶活性變化規(guī)律及其催化去磷酸化反應(yīng)的能力，為改善和保持宰后肉品質(zhì)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇生長環(huán)境一致、飼養(yǎng)條件相同且體質(zhì)量和月齡相近的小尾寒羊與本地羊雜交公羊（7 月齡），屠宰后立即取下雙側(cè)背最長?。╪=3），剔除明顯可見的脂肪與筋膜，切成大小均一的肉塊以便后續(xù)取樣，待宰后30 min，放入液氮速凍，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并保存于－80 ℃。采樣地點(diǎn)為北京二商穆香源清真肉類食品有限公司，采用清真屠宰方式。

堿性磷酸酶活性測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒 美國Thermo公司；蛋白酶抑制劑 德國Roche公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、5’-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、堿性磷酸酶 美國Sigma公司；Pro-Q Diamond染色液、SYPRO Ruby染色液 美國Invitrogen公司；四硼酸鈉、氯化鎂、氯化鉀、甲醇、乙醇、乙酸、乙腈等（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ML204/02電子天平 上海梅特勒-托利多有限公司；FCR1000-UF-E超純水機(jī) 青島富勒姆科技有限公司；TS-2型脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；EMS-19磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；Neofuge高效冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；Research plus微量移液槍 德國Eppendorf公司；MJ-II霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；MSC-100恒溫混勻儀 杭州奧盛儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra System電泳設(shè)備、ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白提取

參考Huang Honggang等[16]的方法略作修改，取1 g羊背最長肌樣品，加入5 mL預(yù)冷的肌漿蛋白提取液（0.039 mol/L四硼酸鈉，0.025 mol/L KCl，5 mmol/L EGTA，蛋白酶抑制劑），冰浴勻漿15 s（1 200 r/min，勻漿4 次，間隔30 s），將所得勻漿配平后在2 000×g、4 ℃條件下離心15 min，待離心結(jié)束后棄掉上清液，在所得沉淀中加入5 mL洗滌液（100 mmol/L KCl，1.0% Triton X-100），在2 000×g、4 ℃離心15 min（2 次）以除去多余肌漿蛋白，棄掉上清液，所得沉淀即為肌原纖維蛋白。在肌原纖維蛋白沉淀中加入10 mL肌原纖維蛋白溶解液（0.4 mol/L KCl、50 mmol/L Tris、1.0 mmol/L DTT），冰浴勻漿15 s。得到的肌原纖維蛋白溶液用BCA法測定蛋白濃度，并保存于－80 ℃。

1.3.2 肌原纖維蛋白孵育

取肌原纖維蛋白溶液，加入堿性磷酸酶純品（25 U/100 g）建立堿性磷酸酶處理組（AP組），對(duì)照組（C組）為不添加堿性磷酸酶的肌原纖維蛋白溶液。孵育條件：25 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育時(shí)間10 min、30 min、1 h、2 h、4 h；15 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育時(shí)間30 min、2 h、4 h、12 h、1 d；4 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育時(shí)間30 min、4 h、12 h、1 d、2 d、4 d。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)留樣，液氮速凍并保存于－80 ℃。

1.3.3 磷酸化水平測定

參照文獻(xiàn)[8,16-18]的方法進(jìn)行肌原纖維蛋白磷酸化水平和堿性磷酸酶磷酸化水平的測定。將50 μL的肌原纖維蛋白溶液與等體積的100 μL上樣緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、pH 6.8、40 g/L SDS、1 g/L溴酚藍(lán)、250 g/L甘油）混合，沸水浴中煮沸5 min，冷卻后12 000×g、離心2 min，上清液即為電泳上樣樣品。電泳采用的分離膠為12%，濃縮膠為4%，上樣量5 μg，每個(gè)蛋白樣品重復(fù)4 次。設(shè)置初始電壓70 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后調(diào)至電壓110 V，待溴酚藍(lán)跑出分離膠后關(guān)閉電源。

電泳結(jié)束后，卸下凝膠用固定液（10%乙酸、50%甲醇）固定2 次（30 min/次），水洗3 次（10 min），Pro-Q Diamond染液避光慢搖70 min進(jìn)行磷酸化蛋白染色，染色完畢后用Pro-Q脫色液（20%乙腈，50 mmol/L乙酸鈉，pH 4.0）脫色2 次（30 min/次），水洗3 次（5 min），采用ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行圖像掃描。待圖像掃描后，用SYPRO Ruby染液避光慢搖5 h進(jìn)行全蛋白染色，染色完畢后用Ruby脫色液（7%乙酸、10%乙醇）脫色2 次（30 min/次），水洗3 次（5 min），采用ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)對(duì)全蛋白進(jìn)行圖像掃描。經(jīng)Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色后的凝膠在掃描時(shí)，激發(fā)波長（532 nm）和分辨率（200 mm）一致，但Pro-Q Diamond染色凝膠的發(fā)射波長為580 nm，而SYPRO Ruby染色凝膠的發(fā)射波長為610 nm[19]。Pro-Q染色后的光密度值（P）和Ruby染色后的光密度值（T）可以采用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行分析[20]。P/T是計(jì)算蛋白質(zhì)磷酸化水平的一種半定量分析[21]，可以衡量肌原纖維蛋白磷酸化水平和堿性磷酸酶磷酸化水平的變化。用對(duì)照組25 ℃孵育0 min時(shí)的樣品作為標(biāo)樣，消除不同凝膠電泳及染色的差異。

1.3.4 堿性磷酸酶活性測定

采用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒（貨號(hào)A059-2）測定AP組的堿性磷酸酶活性。樣品稀釋1 440 倍后，按照試劑盒說明進(jìn)行試劑配制，建立反應(yīng)體系，充分混勻后在不同的孵育溫度（25、15、4 ℃）反應(yīng)15 min，加入顯色液，輕輕振搖孔板混勻，用酶標(biāo)儀在波長520 nm處測定吸光度，平行4 次。堿性磷酸酶活性計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS Statistic 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。肌原纖維蛋白磷酸化水平、堿性磷酸酶磷酸化水平、堿性磷酸酶活性用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和鄧肯多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著，結(jié)果用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白磷酸化水平

圖1 不同溫度、pH值孵育Pro-Q染色和Ruby染色圖Fig. 1 Pro-Q and Ruby staining images of SDS-PAGE gels at different temperatures and pH values

通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光染色分析不同溫度、pH值條件下隨著孵育時(shí)間延長肌原纖維蛋白磷酸化水平變化，結(jié)果如圖1、2所示。從圖1中選取10 個(gè)清晰且明顯可見的電泳條帶進(jìn)行光密度分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)Pro-Q染色10 個(gè)條帶光密度的和（P）與Ruby染色10 個(gè)條帶光密度的和（T）之比為肌原纖維蛋白磷酸化水平。

圖2 不同溫度、pH值孵育肌原纖維蛋白磷酸化水平Fig. 2 Phosphorylation levels of myofibrillar protein at different temperatures and pH values

蛋白質(zhì)經(jīng)磷酸酶催化可以發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，降低蛋白質(zhì)磷酸化水平[22-24]。由圖2可知，隨著孵育時(shí)間的延長，在不同溫度和pH值條件下C組的肌原纖維蛋白磷酸化水平均無顯著變化（P＞0.05），說明不添加堿性磷酸酶的肌原纖維蛋白在孵育過程中不發(fā)生去磷酸化反應(yīng)。pH 6.4條件下，25 ℃孵育4 h AP組肌原纖維蛋白磷酸化水平為0.72，顯著低于此時(shí)C組肌原纖維蛋白磷酸化水平0.95（P＜0.05）；15 ℃每個(gè)孵育時(shí)間AP組肌原纖維蛋白磷酸化水平顯著低于C組肌原纖維蛋白磷酸化水平（P＜0.05）；4 ℃孵育4 d AP組肌原纖維蛋白磷酸化水平為0.96，顯著低于C組肌原纖維蛋白磷酸化水平1.13（P＜0.05），說明在pH 6.4時(shí)溫度高有利于堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)。pH 5.8條件下，25、15、4 ℃孵育4 h、1 d、4 d AP組肌原纖維蛋白磷酸化水平分別為0.78、0.83、0.95，顯著低于C組肌原纖維蛋白磷酸化水平0.99、0.97、1.16（P＜0.05），說明pH 5.8時(shí)溫度高同樣有利于堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)。pH 5.2條件下，不同溫度AP組的肌原纖維蛋白磷酸化水平也未發(fā)生顯著變化（P＞0.05），說明pH 5.2條件下堿性磷酸酶活性被抑制。對(duì)比相同溫度不同pH值結(jié)果表明，pH值高有利于堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)。

綜上，堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白去磷酸化反應(yīng)受溫度和pH值的共同調(diào)控，但當(dāng)溫度或pH值中某一因素更加偏離堿性磷酸酶發(fā)揮最大活性的條件時(shí)，會(huì)成為影響堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白去磷酸化反應(yīng)的限制因素。

2.2 堿性磷酸酶活性

堿性磷酸酶來源不同其理化性質(zhì)也存在一些差異[25]，堿性磷酸酶發(fā)揮活性的最適pH值在9～10左右，最適溫度在40 ℃左右[26-30]。如圖3所示，隨著孵育時(shí)間的延長堿性磷酸酶活性逐漸下降。25 ℃，pH 5.8和pH 6.4孵育1～4 h的堿性磷酸酶活性為15 103.03～16 123.91 U/L，顯著大于pH 5.2孵育1～4 h的堿性磷酸酶活性（P＜0.05），說明25 ℃、pH 5.2抑制堿性磷酸酶活性，使得此條件下堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化程度低，肌原纖維蛋白磷酸化水平較對(duì)照組無顯著變化（P＞0.05）。15 ℃，pH 6.4孵育30 min、12 h、1 d堿性磷酸酶活性顯著大于pH 5.2和pH 5.8孵育30 min、12 h、1 d堿性磷酸酶活性（P＜0.05），說明當(dāng)溫度下降時(shí)，pH值降低對(duì)堿性磷酸酶活性的抑制作用增強(qiáng)。4 ℃、pH 5.2條件下，堿性磷酸酶活性在孵育至第2天時(shí)最高為12 889.27 U/L，說明隨著孵育時(shí)間延長，4 ℃、pH 5.2的條件對(duì)堿性磷酸酶活性抑制作用會(huì)隨著孵育時(shí)間延長而減弱。

比較不同溫度下，同一pH值和孵育時(shí)間的堿性磷酸酶活性，如圖3所示，在同一pH值和孵育時(shí)間下，溫度降低抑制堿性磷酸酶活性，說明溫度偏離堿性磷酸酶最適溫度越大對(duì)堿性磷酸酶活性抑制越強(qiáng)。但15 ℃、pH 5.8孵育2 h和4 h以及15 ℃、pH 6.4孵育30 min的堿性磷酸酶活性稍大于25 ℃同樣條件下的堿性磷酸酶活性，說明此條件下25 ℃和15 ℃對(duì)堿性磷酸酶活性抑制作用相差不大。

圖3 不同溫度、pH值孵育堿性磷酸酶活性Fig. 3 AP activities at different temperatures and pH values

2.3 堿性磷酸酶磷酸化水平

圖4 不同溫度、pH值孵育堿性磷酸酶磷酸化水平Fig. 4 Phosphorylation levels of AP at different temperatures and pH values

本實(shí)驗(yàn)中所用的堿性磷酸酶（貨號(hào)P0114）分子質(zhì)量為140～160 kDa。堿性磷酸酶是一種同源二聚體磷酸單酯酶，在制備用于電泳樣品時(shí)會(huì)使堿性磷酸酶發(fā)生變性，二聚體解體后分子質(zhì)量約為70 kDa[30]，如圖1 AP條帶所示。在孵育過程中堿性磷酸酶磷酸化水平出現(xiàn)顯著變化，結(jié)果如圖4所示。隨著孵育時(shí)間延長，不同溫度和pH值條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平逐漸下降，說明堿性磷酸酶不僅可以催化孵育體系中的肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，也能催化其自身發(fā)生去磷酸化反應(yīng)。25 ℃孵育10 min時(shí)pH 5.2和pH 6.4條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平差異顯著（P＜0.05），15 ℃孵育30 min pH 5.2和pH 6.4條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平差異顯著（P＜0.05），而4 ℃孵育4 h pH 5.2和pH 6.4條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平差異顯著（P＜0.05），說明溫度升高會(huì)使堿性磷酸酶催化其自身發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的時(shí)間提前。不同溫度在孵育后期pH 5.2條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平顯著高于另外2 個(gè)pH值條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平（P＜0.05），說明即使溫度升高，pH 5.2對(duì)堿性磷酸酶催化其自身發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的抑制作用也更強(qiáng)烈。這是由于pH 5.2對(duì)堿性磷酸酶活性抑制作用明顯。通過比較不同溫度和pH值條件下的堿性磷酸酶活性與堿性磷酸酶磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，限制堿性磷酸酶活性變化的主要因素是溫度和pH值。當(dāng)堿性磷酸酶發(fā)生去磷酸化后，其活性會(huì)略微下降，但影響堿性磷酸酶活性的因素主要是溫度和pH值。

3 討 論

磷酸化修飾是一種普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，近年研究表明宰后肌肉中存在蛋白質(zhì)磷酸化修飾，并對(duì)肉品質(zhì)的形成產(chǎn)生一定影響[20,31]。蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)是一種可逆反應(yīng)，在磷酸酶的催化下會(huì)發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，降低蛋白質(zhì)磷酸化水平。有研究表明，堿性磷酸酶活性受溫度和pH值的影響[25]，進(jìn)而影響到其催化去磷酸化反應(yīng)的能力。本研究結(jié)果表明堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，肌原纖維蛋白磷酸化水平降低，與前人研究結(jié)果一致[15,32]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著孵育溫度和pH值的升高，肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的程度增大，時(shí)間提前，這可能和堿性磷酸酶活性受到不同溫度和pH值的影響有關(guān)。Bortolato等[33]研究表明，低溫下酸性pH值會(huì)抑制堿性磷酸酶活性，這與本研究溫度、pH值越低堿性磷酸酶活性越小相一致。pH 5.2接近宰后肉的極限pH值[34]，在此條件下即使孵育溫度升高堿性磷酸酶也不能顯著降低肌原纖維蛋白磷酸化水平，說明此時(shí)堿性磷酸酶活性已被抑制。本團(tuán)隊(duì)研究表明[35]，宰后羊肉在4 ℃貯藏磷酸化水平先升高后逐漸降低，并在貯藏5 d時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，這可能是因?yàn)樵缀驛TP消耗殆盡，磷酸化反應(yīng)結(jié)束，而達(dá)到極限pH值后，去磷酸化反應(yīng)受抑制，故磷酸化水平逐漸穩(wěn)定。前人研究表明，堿性磷酸酶長時(shí)間處于pH 3.4或40～70 ℃的條件會(huì)使α-螺旋受到破壞，二級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸消失，發(fā)生不可逆的失活[36]。

通過分析堿性磷酸酶的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶可以催化自身發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，這可能與堿性磷酸酶是一種非特異性酶有關(guān)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，堿性磷酸酶磷酸化水平變化趨勢比堿性磷酸酶活性和肌原纖維蛋白磷酸化水平明顯，說明當(dāng)堿性磷酸酶自身發(fā)生去磷酸化后，對(duì)堿性磷酸酶活性沒有決定性影響。例如，在pH 5.2條件下，3 個(gè)溫度孵育時(shí)堿性磷酸酶磷酸化水平均變化顯著，但堿性磷酸酶活性變化相對(duì)穩(wěn)定，肌原纖維蛋白磷酸化水平較對(duì)照組無顯著變化。推測堿性磷酸酶自身發(fā)生去磷酸化對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響小于溫度和pH值，這有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶不僅可以催化其他蛋白發(fā)生去磷酸化，也可以催化其自身發(fā)生去磷酸化。而且當(dāng)堿性磷酸酶自身去磷酸化后，對(duì)堿性磷酸酶活性影響較小，影響堿性磷酸酶活性的因素主要是溫度和pH值。當(dāng)pH值較低時(shí)，堿性磷酸酶活性被抑制程度高，不能降低肌原纖維蛋白磷酸化水平。在一定范圍內(nèi)，溫度和pH值升高可以使堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白去磷酸化能力增強(qiáng)，作用時(shí)間提前，這為通過降低宰后肉中磷酸化水平而改善肉部分食用品質(zhì)提供理論依據(jù)。