HPLC法測定鹽酸左旋咪唑片的含量研究

周芷錦，林仙軍，王彬，陳曉林

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311101)

左旋咪唑是一種廣譜驅(qū)蟲藥，廣泛應用于獸醫(yī)臨床治療畜禽胃腸道線蟲病、肺絲蟲病和豬腎蟲病當中。除作為驅(qū)蟲藥之外，鹽酸左旋咪唑還具有免疫調(diào)節(jié)作用，是一種免疫增強劑，能提高巨噬細胞的吞噬能力，增強機體的體液免疫功能和細胞免疫功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸左旋咪唑可顯著提高脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)，對雛雞有顯著的增重效果，在一定程度上提高生長性能[2]。目前獸醫(yī)使用中常見的劑型包括鹽酸左旋咪唑片、鹽酸左旋咪唑注射液。目前鹽酸左旋咪唑片在《中國獸藥典(2015年版)》一部[3]，《美國藥典》(USP40-NF35)[4]中均有收入。《中國獸藥典(2015年版)》一部[3]中，含量測定標準采用氯仿提取，高氯酸滴定的方法。該方法主要存在氯仿毒性較大，且過程較為繁瑣，容易出現(xiàn)誤差較大等問題。《美國藥典》[4]采用高效液相色譜法，但對實驗室儀器設備有較高的要求?；谖墨I參考[4-6]，本著優(yōu)化簡化實驗條件和方法的目的，本文探討用高效液相色譜法測定鹽酸左旋咪唑片中鹽酸左旋咪唑含量的方法研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀，Angilent 1260，配Angilent DAD檢測器；METTLER TOLEDO XS205電子天平；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLER TOLEDO 320酸度計。

1.2試劑 乙腈、甲醇均為色譜純，德國默克公司；磷酸二氫鉀、磷酸、三乙胺均為分析純；水為超純水。鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌穪碓礊橹袊称匪幤窓z定研究院，批號100167-201203，含量99.9%。

1.3 樣品 實驗樣品由杭州新港動物藥業(yè)有限公司等四家單位提供，4個批次25mg規(guī)格的樣品批號分別為：20190101,180529,190122,20180703；2個批次50 mg規(guī)格的樣品批號分別為：170901,190301。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液配制 取鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌芳s10 mg，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加入適量流動相溶解，并用流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 供試品溶液配制 取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于鹽酸左旋咪唑50 mg)，置100 mL容量瓶中，加入流動相適量，超聲10 min溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻；過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，用流動相定容，搖勻。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Agilent Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至7.0)-乙腈(80∶20,v/v)；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；用二極管陣列檢測器在190～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，記錄214 nm波長處的色譜圖。鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌饭庾V圖(圖1)，鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌啡芤荷V圖(圖2)，供試品溶液色譜圖(圖3)。

圖1 鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌啡芤汗庾V圖Fig 1 Spectrogram of Levamisole Hydrochloridereference substance

圖2 鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌啡芤荷V圖Fig 2 Solution chromatogram of LevamisoleHydrochloride reference substance

圖3 供試品溶液色譜圖Fig 3 Solution chromatogram of the sample

2.3 線性關系考察 取鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌?，精密稱定，加流動相制成100 μg/mL的溶液，并配制成1、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL等一系列濃度的對照品溶液。分別精密吸取20 μL,注入色譜儀，測定。以對照品濃度(X)為橫坐標，峰面積值(Y)為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。在1.024～102.398 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，線性回歸方程為Y=89.715X+14.765,線性相關系數(shù)為1.0000。

2.4 回收率試驗 以批號190301的樣品作為本底樣品，精密稱取9份，每三份為一組，稱取量為應稱取樣品量的一半(約相當于鹽酸左旋咪唑25 mg)，置100 mL容量瓶中；另精密稱取鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌?，高、中、低濃度對照品加入量按照應稱取量的80 %、100 %、120%的比例加入上述的三組100 mL容量瓶中，并按照2.1.2的方法配制回收率試驗用溶液。按照2.2色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀中，記錄色譜圖。計算回收率，回收率=(實測量/加入量)×100 %，實測添加量=測得總量-本底鹽酸左旋咪唑量?；厥章式Y(jié)果如表1所示，平均回收率為97.4 %、99.7 %、99.3 %，說明檢測方法的準確度良好。

表1 回收率結(jié)果表Tab 1 Results of recovery tate

2.5 精密度 取回收率試驗的9份樣品測定，RSD值按照高、中、低濃度三組分別為0.9%，0.8%，0.6%，說明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取重復性試驗的供試品溶液，在0，1.5，3，6，12，16 h時間點進樣，測得器峰面積分別為4483.87744，4474.66260，4492.76318，4482.00439，4516.70264，4501.69922，其檢測結(jié)果的RSD為0.3%，說明在16 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.7 耐用性試驗 采用三臺不同的液相和三根不同品牌的色譜柱分三組對批號為20190101的樣品進行含量測定。A組為Agilent 1260 DAD液相色譜儀，配Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；B組為Agilent 1260 VWD液相色譜儀，配Waters C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；C組為Waters 2695-2487液相色譜儀，配Agilent C18(4.6 mm×150 mm ，5 μm)液相色譜柱。樣品配制方法如2.1.2，色譜條件見2.2，含量測定結(jié)果如表2所示，同一樣品三組含量測定結(jié)果分別為100.5%，101.3%，101.2%，RSD值為0.5%，說明該檢測方法對液相和色譜柱品牌無特殊要求，耐用性良好。

2.8 實際樣品含量測定 取1.3中的所有樣品，每個樣品平行3次，依法測定其含量，結(jié)果見表3。

表2 不同液相與不同品牌色譜柱的含量測定比較Tab 2 Comparison of content determination of different HPLC and different brand columns

表3 液相測定結(jié)果Tab 3 Determination results of HPLC

3 討論與結(jié)論

3.1 與容量分析結(jié)果比較 取6批次樣品，按照《中國獸藥典(2015年版)》一部中鹽酸左旋咪唑片的含量測定項下的滴定法進行測定，結(jié)果見表4，并與高效液相色譜法比較，兩者相對偏差均不超過1.0%，結(jié)果無顯著差異。但滴定法存在以下問題：一是需使用毒性較大的三氯甲烷進行提?。欢遣襟E過長過多，實驗誤差較大；三是終點藍色難以判斷，容易過終點誤讀，導致實驗結(jié)果偏高。相比較而言，高效液相色譜法更簡便，也無需三氯甲烷、醋酐等危險化學試劑，更有利于實驗的開展，實驗結(jié)果也更為準確可靠。

表4 液相含量測定與容量分析結(jié)果比較Tab 4 Comparisons between HPLC and volumetric analysis

3.1 提取方式的選擇 在提取溶劑選擇上，分別采用了65%甲醇、甲醇和流動相三種溶劑進行超聲提取。結(jié)果表明純甲醇提取后樣品峰形較差，65%甲醇和流動相提取后的樣品峰形較好，本文采用了流動相提取。在是否過濾的選擇上，過濾與不過濾峰面積相對偏差為0.2%，對含量測定影響不大，由于過濾后溶液更澄清，更有利于第二步配制，本文采用了過濾的方法。在超聲時間的選擇上，實驗過程中分別采用了超聲5、10、20 min三種方式，峰面積分別為5255.33350,5262.27686,5247.13623,RSD為0.1%，因此選擇超聲時間為10 min。

3.2 檢測波長的選擇 對鹽酸左旋咪唑溶液在190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，掃描結(jié)果表明在212 nm波長處有最大吸收，結(jié)合文獻[5]-[6]報道中基本選擇214 nm為檢測波長，基于212和214 nm屬于光譜掃描誤差內(nèi)，因此還是選擇214 nm為檢測波長，與文獻保持一致。

3.3 流動相的選擇 本文采用了甲醇-0.2%磷酸溶液以及乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液兩種流動相配比進行試驗，供試品溶液采用流動相進行稀釋配制成50 μg/mL的溶液。結(jié)果表明，甲醇-0.2%磷酸溶液流動相下的鹽酸左旋咪唑峰峰形不理想，峰形有較明顯的拖尾現(xiàn)象，且有較明顯的溶劑吸收峰，出峰時間在8 min左右，理論板數(shù)在8000左右。而乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至7.0)(20∶80,v/v)的流動相下的鹽酸左旋咪唑峰峰形對稱性良好，無干擾，無拖尾，出峰時間在13 min左右更為合理，無明顯的溶劑吸收峰，理論板數(shù)在10000以上。因此選擇后者作為流動相更適宜。

采用高效液相色譜法對鹽酸左旋咪唑片中鹽酸左旋咪唑的含量進行測定，對提取溶劑，提取方式和色譜條件進行了研究和優(yōu)化，方法學驗證結(jié)果表明該方法定量準確，與現(xiàn)行有效標準的含量結(jié)果一致，為鹽酸左旋咪唑片的質(zhì)量控制提供了更快捷、便利的操作方法。