嘉寶果嫩葉提取物不同極性部位抗氧化及抑制α葡萄糖苷酶活性研究

邱珊蓮 林寶妹 張少平 張樹河 張帥 洪佳敏 鄭開斌

摘 ?要 ?從植物中尋找天然的抗氧化劑和α葡萄糖苷酶抑制劑對(duì)糖尿病患者具有重要的意義。采用比色法對(duì)嘉寶果嫩葉醇提物不同極性部位進(jìn)行總多酚和總黃酮含量、抗氧化活性及α葡萄糖苷酶活性抑制活性研究，以期為嘉寶果嫩葉有效提取部位在食品、化工及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。結(jié)果表明，乙酸乙酯相的總多酚含量（33.92 mg/g及總黃酮含量（13.35 mg/g）最高，其次為正丁醇相（總多酚31.11 mg/g;總黃酮12.93 mg/g）及水相（總多酚17.04 mg/g;總黃酮11.18 mg/g）;石油醚相及二氯甲烷相均未檢測(cè)到總多酚及總黃酮。乙酸乙酯相與正丁醇相對(duì)DPPH及ABTS+自由基的清除能力相當(dāng)，明顯高于其他極性部位。對(duì)酵母源和小鼠小腸源α葡萄糖苷酶活性抑制活性大小依次分別為乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>石油醚相>二氯甲烷相和乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>二氯甲烷相>石油醚相。以上結(jié)果表明嘉寶果嫩葉乙酸乙酯相與正丁醇相總多酚及總黃酮含量較高，抗氧化活性及對(duì)α葡萄糖苷酶活性的抑制作用較強(qiáng)，是挖掘抗氧化及抑制α葡萄糖苷酶活性物質(zhì)的主要極性部位。

關(guān)鍵詞 ?嘉寶果;嫩葉;醇提物;不同極性部位;抗氧化;α葡萄糖苷酶

中圖分類號(hào) ?S667.9 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?It is of great significance to search for natural antioxidants and α-glucosidase inhibitors from plants to diabetic patients. Based on the previous research， the polarity fractions of the ethanol extracts from the tender leaves of M. cauliflora were applied to determine the scavenging effects towards DPPH and ABTS+ free radicals， inhibition on α-glucosidase activity， the contents of total polyphenols （TP） and total flavonoids （TF） by colorimetry， providing a reference evidence for the application of effective polarity fraction from the tender leaves of M. cauliflora in food， chemical and medical fields. The ethyl acetate fraction exhibited the highest contents of TP （33.92 mg/g） and TF （13.35 mg/g）， followed by n-butanol?fraction （TP 31.11 mg/g; TF 12.93 mg/g） and water fraction （TP 17.04 mg/g; TF 11.18 mg/g）. TP and TF were not detected in the petroleum ether and dichloromethane fractions. The scavenging abilities of n-butanol fraction and ethyl acetate fraction towards DPPH and ABTS+ radicals were higher than that of other fractions. The ethyl acetate fraction had the strongest inhibitory activity in the α-glucosidase， followed by the n-butanol and water fraction. This results indicated that the contents of TP and TF were higher in the ethyl acetate and n-butanol fractions， and the antioxidant activity and inhibition in α-glucosidase activity were stronger， compared with the other three polarity fractions， so the ethyl acetate and n-butanol fractions could be used as the main polar fractions to excavate active substances for antioxidation activity and inhibition activity in α-glucosidase.

Keywords ?Myrciaria cauliflora; young leaves; ethanol extracts; different polarity fractions; antioxidation; α-glucosidase

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.018

嘉寶果[Myrciaria cauliflora （DC.） Berg]，又名樹葡萄、珍寶果、肖檉柳桃金娘、擬愛神木，為桃金娘科擬香桃木屬常綠灌木，是南美洲的一種常見果樹，中國大陸近年來栽植的嘉寶果均引自中國臺(tái)灣地區(qū)。果實(shí)營養(yǎng)成分豐富，富含維生素C、硒、鎂等營養(yǎng)元素[1]，果皮富含花青素、沒食子酸、槲皮苷、異槲皮苷等功能成分[2-3]，具有良好的抗氧化、抗癌細(xì)胞增殖、抗菌、減少胰島素抵抗等生物活性[4-5]。

α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸黏膜刷狀緣α-葡萄糖苷酶對(duì)食物中淀粉和糖類的降解，延遲并減少葡萄糖的吸收，從而達(dá)到降低餐后血糖效果[6]，是適用于Ⅱ型糖尿病患者、能明顯改善餐后血糖的藥物，如阿卡波糖和伏格列波糖等。近十幾年來的研究表明Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)理是氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激導(dǎo)致組織損害是體內(nèi)大量自由基產(chǎn)生及機(jī)體抗氧化能力減弱的結(jié)果[7-8]。抗氧化劑可減少自由基的產(chǎn)生或直接淬滅體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，并增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，是預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的有效手段[9]。因此，治療糖尿病及防治并發(fā)癥，應(yīng)強(qiáng)調(diào)抗氧化應(yīng)激與控制血糖并重。但是，目前常用的抗氧化劑及α-葡萄糖苷酶抑制劑多為西藥，存在較多毒副作用，也不能有效地控制并發(fā)癥，植物天然產(chǎn)物降糖作用具有多途徑、多靶點(diǎn)、多向性的藥理特點(diǎn)，不僅可降低血糖，還具有抗氧化及降血脂作用[10-11]，作用溫和持久，并能延緩并發(fā)癥的發(fā)生。筆者前期的報(bào)道顯示嘉寶果植株不同器官中嫩葉具有最高的多酚及黃酮含量及最強(qiáng)的抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性作用[12]，但該報(bào)道僅限于粗提物，本研究對(duì)嘉寶果嫩葉乙醇提取物進(jìn)行不同極性溶劑萃取分部，測(cè)定各極性部位中多酚及黃酮含量，研究各極性部位抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性，為嘉寶果嫩葉的深度開發(fā)利用提供參考。

1 ?材料和方法

1.1 ?材料

嘉寶果嫩葉于2018年1月23日采自福建龍海市惠昌嘉寶果專業(yè)合作社，供試嘉寶果品種為‘沙巴，隨機(jī)選取9株樹齡為15?a的植株采取嫩葉。嫩葉位于為枝條頂部，呈紅色，質(zhì)地柔嫩且葉脈不清晰。

1.2 ?方法

1.2.1 ?嫩葉醇提液的制備 ?將采集的嘉寶果嫩葉用粉碎機(jī)粉碎1 min（28 000 r/min），取4?g粉碎樣品與40%乙醇按1∶60料液比混合后進(jìn)行超聲輔助提取10 min，固定超聲波破碎儀功率為195?W，連續(xù)超聲時(shí)間3?s，超聲間隔時(shí)間4?s。提取液離心15?min（6000 r/min），取上清液，減壓濃縮至40 mL，得濃縮液（粗提液）。另取一部分嫩葉，稱其鮮重后，烘干至恒重，計(jì)算干物質(zhì)百分含量，用于換算干樣質(zhì)量。

1.2.2 ?極性分部試驗(yàn) ?將濃縮液依次用等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次，合并萃取液，正丁醇萃取后的剩余水溶液即水相提取物。將石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相和正丁醇相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮再經(jīng)真空干燥箱40?℃干燥至近干，用無水乙醇溶解，定容至40?mL。

1.2.3 ?小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶的分離 ?取正常小鼠進(jìn)行解剖，取其小腸，用手術(shù)剪剖開，用預(yù)冷的0.9%生理鹽水充分沖洗干凈，濾掉水分，按1∶10的重量比加入0.9%生理鹽水進(jìn)行勻漿5?min，勻漿液于4?℃、10 000 r/min離心15 min，取上清，于4?℃過夜，再離心15?min，得到小鼠小腸α葡萄糖苷酶酶液，20?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ?總多酚及總黃酮含量的測(cè)定 ?總多酚及總黃酮含量測(cè)定參照林寶妹等[13]的方法。總多酚及總黃酮的含量以嫩葉干重計(jì)。

1.2.5 ?抗氧化活性的測(cè)定 ?DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照Li等[14]的方法;ABTS+自由基清除能力測(cè)定參照Hu等[15]的方法。

1.2.6 ?α-葡萄糖苷酶活性抑制率測(cè)定 ?酵母源α-葡萄糖苷酶活性抑制率測(cè)定參照邱珊蓮等[12]的方法。小鼠小腸源α葡萄糖苷酶活性抑制率采用酶標(biāo)儀測(cè)定，取40 μL小鼠α葡萄糖苷酶，加入40 μL樣品溶液，37?℃恒溫水浴5 min，然后加入20 μL 15 mmol/L PNPG，搖勻后再于37?℃恒溫水浴15 min后，加入0.2 mol/L碳酸鈉溶液100 μL，于入射光波長405 nm處測(cè)定吸光度。酶活性抑制率=[1（A1A2）/A0]×100%，式中：A0為溶劑空白對(duì)照管吸光值;A2為樣品本底值;A1為樣品管吸光值。試驗(yàn)中將樣品溶液配制成不同濃度梯度溶液，測(cè)定各濃度樣品液對(duì)α葡萄糖苷酶活性的抑制率，繪制抑制率（y）樣品濃度（x）曲線，生成回歸方程，由曲線讀出或用方程計(jì)算出半數(shù)抑制濃度IC50，單位為嫩葉干質(zhì)量濃度。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行線性/對(duì)數(shù)回歸曲線制作;采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 ?結(jié)果和分析

2.1 ?總多酚與總黃酮含量

嘉寶果嫩葉提取物不同極性部位的總多酚與總黃酮含量見表1，粗提液中總多酚含量為91.09?mg/g，不同極性部位的多酚含量差異顯著（P<0.05），石油醚相及二氯甲烷相未檢測(cè)到多酚，大部分多酚集中于乙酸乙酯相（33.92 mg/g）和正丁醇相（31.11 mg/g），乙酸乙酯相的多酚含量最高，其次為正丁醇相和水相（17.04 mg/g）。

2.2 ?抗氧化活性

2.2.1 ?對(duì)DPPH自由基的清除能力 ?嘉寶果嫩葉提取物不同極性部位對(duì)DPPH自由基的清除能力見表2。不同極性部位對(duì)DPPH自由基的清除能力差異明顯，各極性部位的清除能力均小于粗提液。因石油醚相及二氯甲烷相對(duì)DPPH自由基的清除能力弱，未獲得線性回歸方程并求得IC50，其余3個(gè)極性部位在一定的濃度范圍內(nèi)，提取物濃度與DPPH自由基的清除率之間呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，R2均大于0.95，以正丁醇相（IC50為 0.9473 g/L）的清除能力最強(qiáng)，乙酸乙酯相（IC50為0.9681 g/L）與其接近，水相清除能力較弱（IC50為2.0365 g/L）。

2.2.2 ?對(duì)ABTS+自由基的清除能力 ?嘉寶果嫩葉提取物不同極性部位對(duì)ABTS+自由基的清除能力見表3。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各極性部位提取物對(duì)ABTS+自由基的清除作用隨提取物濃度的增加而增強(qiáng)，二者呈線性關(guān)系，R2值均大于0.99。不同極性部位對(duì)ABTS+自由基的清除能力大小順序依次為乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>石油醚相>二氯甲烷相，各極性部位的清除能力均小于粗提液，正丁醇相與乙酸乙酯相的清除能力接近。

2.3 ?對(duì)α葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.3.1 ?對(duì)酵母源α葡萄糖苷酶活性的抑制作用 ?嘉寶果嫩葉提取物不同極性部位對(duì)酵母源α葡萄糖苷酶活性的抑制效果見表4。粗提液對(duì)酵母源α葡萄糖苷酶活性的抑制作用最強(qiáng)，高于各極性部位提取物，乙酸乙酯相提取物的抑制活性（IC50 8.3758 mg/L）與粗提液（IC50 7.7288 mg/L）較接近。各極性部位對(duì)酵母源α葡萄糖苷酶的抑

2.3.2 ?對(duì)小鼠小腸源α葡萄糖苷酶活性的抑制作用 ?嘉寶果嫩葉提取物不同極性部位對(duì)小鼠小腸源α葡萄糖苷酶活性的抑制效果見圖1。在同一質(zhì)量濃度（10 mg/L）下，粗提物及各極性部位對(duì)小鼠小腸源α葡萄糖苷酶的抑制率從大到小依次為乙酸乙酯相（20.69%）>粗提液（15.66%）>正丁醇相（12.87%）>水相（10.51%）>二氯甲烷相（5.00%）>石油醚相（3.96%），與對(duì)酵母源α-葡萄糖苷酶的抑制活性相比，差異表現(xiàn)在乙酸乙酯相的抑制活性高于粗提液。

3 ?討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與Ⅱ型糖尿病及其大血管或微血管并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)多種抗氧化劑通過不同的抗氧化機(jī)制在Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的防治中具有重要作用[16]。近些年來，從植物中尋找天然抗氧化劑代替人工合成的抗氧化劑已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明嘉寶果植株各部位中嫩葉醇提取物對(duì)DPPH·、·OH及ABTS+ 3種自由基具有最強(qiáng)的清除作用，且在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨提取液濃度的增加而增強(qiáng)[12]，但前期該研究?jī)H局限于粗提物，并未對(duì)醇提物的有效部位進(jìn)行研究。本研究通過對(duì)嘉寶果嫩葉醇提物不同極性部位抗氧化能力的比較，發(fā)現(xiàn)嘉寶果嫩葉不同極性部位對(duì)DPPH·和ABTS+2種自由基的清除能力差異較大，其中乙酸乙酯相和正丁醇相的清除能力最強(qiáng)，其次為水相，石油醚及二氯甲烷相較弱。本研究結(jié)果與大多植物提取物不同極性部位抗氧化活性研究結(jié)果相類似，即各極性部位中乙酸乙酯相和正丁醇相的抗氧化作用明顯強(qiáng)于其他極性部位，如山茱萸[17]、女貞子[18]、香椿葉[19]、覆盆子[20]、芒果葉[21]、豆腐柴葉[22]等，存在差異的是除乙酸乙酯及正丁醇相以外的其他部位抗氧化活性大小差異較大，例如豆腐柴葉水相對(duì)DPPH·及ABTS+ 2種自由基的清除率高于石油醚相[22]，這與本研究結(jié)果相一致，而芒果葉的石油醚相對(duì)DPPH·的清除作用卻強(qiáng)于水相[21]，這種現(xiàn)象可能與研究材料本身所含成分差異有關(guān)。

本研究得出嘉寶果嫩葉乙酸乙酯及正丁醇部位抗氧化活性最強(qiáng)且兩者相差不大，但遠(yuǎn)高于其他極性部位，可見嫩葉中大多數(shù)抗氧化活性成分與乙酸乙酯及正丁醇的極性接近。試驗(yàn)結(jié)果顯示嘉寶果嫩葉的總多酚成分主要集中于乙酸乙酯相與正丁醇相，約占總含量的71.39%，其次為水相，占18.71%;總黃酮?jiǎng)t相對(duì)較均勻地分布在乙酸乙酯相、正丁醇相及水相，分別占總含量的32.48%、31.46%、27.20%，由此可見抗氧化活性的大小與總多酚含量關(guān)系密切。該研究結(jié)果與覆盆子相關(guān)報(bào)道[20]較一致，即覆盆子醇提物及其不同極性部位的總酚含量與抗氧化能力間存在較好的正相關(guān)性，總酚含量越高，提取物的抗氧化活性就越強(qiáng)。但是，本研究結(jié)果也表明抗氧化能力并不完全取決于總多酚含量，例如，嘉寶果嫩葉乙酸乙酯相的總多酚含量顯著高于正丁醇相，但乙酸乙酯相對(duì)DPPH自由基的清除能力低于正丁醇相，該研究結(jié)果與菠蘿皮渣[23]報(bào)道相似，菠蘿皮渣正丁醇相多酚含量（44.18?mg/mL）高于石油醚相（12.27?mg/mL），但是正丁醇相對(duì)DPPH·和·OH的清除能力卻明顯低于石油醚相，表明醇提物不同極性部位抗氧化活性除與其多酚含量有關(guān)外，還與其他成分有關(guān)。

嘉寶果嫩葉不同極性部位對(duì)α葡萄糖苷酶的抑制活性以乙酸乙酯相和正丁醇相的抑制作用最強(qiáng)，水相次之，石油醚相及二氯甲烷相最弱，該結(jié)果與抗氧化活性類似，但與抗氧化活性存在差異的是嘉寶果嫩葉乙酸乙酯相與正丁醇相對(duì)2種不同來源的α葡萄糖苷酶的抑制作用表現(xiàn)為乙酸乙酯相抑制活性明顯高于正丁醇相，該結(jié)果與對(duì)雪菊[24]、白花丹根[25]的研究結(jié)果一致，但甘草[26]中酶活性抑制率大小依次為乙酸乙酯相（83.2%）>石油醚相（68.93%）>正丁醇相（32.17%）>水相（10.79%），且酶抑制活性最強(qiáng)的活性成分為甘草黃酮和甘草次酸?？梢姴煌参镏杏行Щ钚猿煞謴?fù)雜多樣。本研究結(jié)果表明抑制α葡萄糖苷酶的有效活性成分最多集中于乙酸乙酯相，其次為正丁醇相，該活性可能與總多酚及總黃酮含量均有關(guān)。因此，乙酸乙酯相及正丁醇相可以作為嘉寶果葉活性成分的主要極性部位進(jìn)行活性成分分離、結(jié)構(gòu)鑒定及活性跟蹤等深入研究。

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