芒果MinMYB10基因的克隆及表達(dá)分析載體的構(gòu)建

白蓓蓓 荊永琳 藍(lán)麗 王佳 趙志常

摘 ?要 ?MYB（myeloblastosis）轉(zhuǎn)錄因子主要參與調(diào)控植物類黃酮代謝、植物生長(zhǎng)發(fā)育等。為了研究在芒果果實(shí)中類黃酮代謝調(diào)控機(jī)制，本研究從金煌果肉中克隆得到一個(gè)MYB基因，將其命名為MinMYB10，其全長(zhǎng)cDNA序列為1021?bp，開放閱讀框?yàn)?37 bp。該基因編碼的蛋白有278個(gè)氨基酸殘基，分子重量為31.60 ku，等電點(diǎn)為5.89。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)MinMYB10與擬南芥是親緣關(guān)系較近的蛋白。本研究還構(gòu)建了基因沉默載體pTRV2-MinMYB10和過表達(dá)載體 pGreenII 62-SK-MinMYB10，以期在后續(xù)研究中探明MinMYB10基因在芒果果實(shí)花青素代謝中的作用。

關(guān)鍵詞 ?芒果;MinMYB10基因;載體構(gòu)建

中圖分類號(hào) ?S667.7 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?The MYB （myeloblastosis） transcription factors are mainly involved in the regulation of flavonoid metabolism， growth and development in plants. In order to study how the flavonoid metabolic pathways are regulated in mango fruit， a MYB gene， designated as MinMYB10， was cloned from the flesh of Jinhuang mango fruit. The full-length cDNA sequence of MinMYB10 was 1021 bp long， containing an open reading frame of 837 bp which would encode a peptide of 278 amino acid residues with a molecular weight of 31.60 ku and an isoelectric point of 5.89. Phylogenetic analysis showed that the encoded protein sequence was closely related to its homolog from Arabidopsis thaliana. We have also constructed a silencing vector， pTRV2-MinMYB10， and an over expression vector， pGreenII 62-SK-MinMYB10， aiming to decipher the role of MinMYB10 in the metabolism of anthocyanin in mango fruit in our upcoming researches.

Keywords ?mango; MinMYB10 gene; vector construction

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.008

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）又稱反式作用因子，可以與真核基因的啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，是一類在生物體廣泛存在的蛋白質(zhì)分子[1]。轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain）、寡聚化位點(diǎn)（oligomerization site）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（transcription regulation domain）和核定位信號(hào)區(qū)（nuclear location signal）這4個(gè)功能區(qū)域組成[2]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，主要參與調(diào)控植物類黃酮代謝、植物生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)答外界壞境和植物刺激等生理過程[3-7]。

芒果（Mangifera indica L.），屬漆樹科常綠大喬木，又名密望子、柁果、望果等。芒果樹壽命可達(dá)幾百年，原產(chǎn)印度及馬來西亞[8]。其所含有黃酮類成分很高，在所有水果中少見，維生素C含量也不低，礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等，也是其主要營養(yǎng)成分。目前，關(guān)于芒果MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)果實(shí)類黃酮代謝反應(yīng)調(diào)控機(jī)制研究報(bào)道較少[9]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上克隆得到一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因MYB10，命名為MinM YB10，同時(shí)對(duì)其編碼的蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并進(jìn)一步構(gòu)建了沉默表達(dá)載體和過表達(dá)載體，為深入研究該轉(zhuǎn)錄因子的功能奠定基礎(chǔ)，也為解析芒果果實(shí)花青素合成的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究所用試材均取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所的農(nóng)業(yè)部儋州芒果種質(zhì)圃，以金煌芒為試材。使用的試劑有TaKaRa PrimerSTAR Max DNA Polymerase、rTaq、克隆載體pEASY?-Blunt、大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?芒果果肉總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄 ?芒果果肉總RNA的提取參照天根公司生產(chǎn)的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行相關(guān)的操作，cDNA合成方法詳見全式金公司TransScript?-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書。

1.2.2 ?MinMYB10基因的克隆 ?根據(jù)前期已經(jīng)拼接得到的該基因的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)上下游特異性引物擴(kuò)增MinMYB10基因。PCR反應(yīng)體系：1?μL?cDNA模板，上下游引物（10?pmol/μL）各0.5?μL，10?μL?TaKaRa PrimerST AR MaxDNA聚合酶和8 μL ddH2O;PCR反應(yīng)程序：98?℃預(yù)變性5?s;98?℃ 10 s，55?℃ 15?s，72?℃ 6 s，35個(gè)循環(huán);72?℃延伸10 min，4?℃保存?zhèn)溆谩＿B接pEASY- blunt載體，轉(zhuǎn)化到Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌液送公司測(cè)序。

1.2.3 ?MinMYB10基因的生物信息學(xué)分析 ?利用NCBI上的ORF finder（https：//www.nc bi.nl m.nih.gov/orffinder/）查找MinMYB10基因的開放閱讀框，并推測(cè)其氨基酸序列;運(yùn)用ExPASy ProtParam軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析MinMYB10蛋白理化性質(zhì);使用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）軟件分析氨基酸的疏水性與親水性;使用DNAMAN和Prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）軟件分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)模型;使用SWI S S-MODEL（https：//swissmod el.expa sy.or g/I n t er acti ve/SW3VtZ/models/）在線軟件預(yù)測(cè)并構(gòu)建MinM YB10蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型;利用NCBI上的Blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索Min M YB10蛋白的同源序列;使用NCBI中的Conserved domains（https：//www.ncbi.nl m.nih.g ov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi？RID=NG6HM4 ME014 & m ode=all）分析MinMYB10蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域;利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 ?載體構(gòu)建 ?（1）pTRV2-MinMYB10基因沉默載體的構(gòu)建。首先使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ對(duì)載體pTRV2和目的基因MinMYB10進(jìn)行雙酶切。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別將目的基因和酶切后的載體條帶進(jìn)行切膠回收。然后用T4連接酶（全式金公司）22?℃連接20 min，連接體系為：pTRV2載體片段1 μL，MinMYB10目的基因片段4 μL，T4連接酶0.2?μL，10T4 Buffer 1 μL，ddH2O 3.8?μL。轉(zhuǎn)化到Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌液擴(kuò)繁提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，最后轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)，篩選陽性菌液，將菌液與50%的甘油按照體積1∶1混合，于?80?℃保存。

（2）pGreenII 62-SK-MinMYB10基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建。首先使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)載體pGreenII 62-SK和目的基因MinMYB10進(jìn)行雙酶切。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別將目的基因和酶切后的載體條帶進(jìn)行切膠回收。然后用T4連接酶（全式金公司）22?℃連接20?min，連接體系為：pGreenII 62-SK載體片段1 μL，MinMYB10目的基因片段4 μL，T4 連接酶0.2 μL，10T4 Buffer 1 μL，ddH2O 3.8 μL。轉(zhuǎn)化到Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌液擴(kuò)繁提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，最后轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)，篩選陽性菌液，將菌液與50%的甘油按照體積1∶1混合，于?80?℃保存。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?金煌芒果果肉總RNA的提取

提取金煌芒果果肉總RNA，用核酸蛋白儀測(cè)定其濃度800～1000?ng/μL，純度OD260/OD280的比值為1.8～2.0，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有2條清晰完整的條帶（圖1）。

2.2 ?MinMYB10基因全長(zhǎng)的克隆

以金煌芒完熟期果肉cDNA為模板，以O(shè)RF兩側(cè)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR得到MinMYB10基因的cDNA全長(zhǎng)。在1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖上，目的片段約1000?bp（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序后，利用ORF finder分析得到基因CDS區(qū)為837?bp，編碼278個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為31.60 ku，等電點(diǎn)為5.89。

2.3 ?MinMYB10基因序列、同源性、結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化樹分析

根據(jù)MYB10基因編碼蛋白序列，在NCBI上利用Blast P搜索并下載該蛋白的同源序列。選擇與MinMYB10同源性較高的物種進(jìn)行同源比對(duì)，物種分別為芒果（Mangifera indica L.）、可可（Theo broma cacao）、榴蓮（Durio zibethinus）、亞錦葵（Herrania umbratica）和葡萄（Vitis vinifera），可了解它們之間的親緣關(guān)系（圖3）。使用NCBI上的Conserved domains分析MinMYB10蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示MinMYB10含有PLN0 3 212、

MinMYB10： MYB10 of Mangifera indica L.; TcaMYB10： MYB10 of Theobroma cacao; HumMYB10： MYB10 of Herrania umbratica; DziMYB10： MYB10 of Durio zibethinus; VviMYB10： MYB10 of Vitis vinifera.

2.4 ?MinMYB10基因載體的構(gòu)建

2.4.1 ?pTRV2-MinMYB10基因沉默載體的構(gòu)建 ?首先使用Takara PrimerSTAR MaxDNA聚合酶擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收目的條帶，將pTRV2空載體和目的基因MinMYB10用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收目的條帶，然后利用T4連接酶連接回收條帶，構(gòu)建沉默載體pTRV2-MinMYB10，轉(zhuǎn)化到Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌液進(jìn)行擴(kuò)繁，之后提取pTRV2-MinMYB10重組質(zhì)粒，再用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切目的基因片段為1000 bp（圖9A），與預(yù)期結(jié)果相吻合，表明pTRV2-MinMYB10重組質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建成功。pTRV2-MinMYB10轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌，菌液PCR檢測(cè)到目的基因已成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株（圖9B）。

2.4.2 ?pGreenII 62-SK-MinMYB10基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建 ?首先使用Takara PrimerSTAR MaxDNA聚合酶擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收目的條帶，將pGreenII 62-SK空載體和目的基因MinMYB10用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)

3 ?討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子N端含有MYB保守結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域由50多個(gè)氨基酸組成。MYB轉(zhuǎn)錄因子含有1～3個(gè)不完全重復(fù)的串聯(lián)結(jié)構(gòu)域（R1、R2和R3）[10]。依據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目不同，MYB轉(zhuǎn)錄因子分為4個(gè)亞類：1R-MYB、2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB（four R1/R2）[11]。MYB轉(zhuǎn)錄因子雖然在序列上具有一定的保守性，但在不同物種、不同個(gè)體或同一個(gè)體的不同組織器官中發(fā)揮著不同的功能。如：擬南芥中AtMYB21和AtMYB24通過調(diào)控植物激素茉莉酸的合成來影響花青素的積累[12]。研究發(fā)現(xiàn)楊樹的PtrMYB3和PtrMYB20[13]，小麥的TaMYB4[14]、水稻的OsMYB46和玉米的ZmMYB31等[15]均參與細(xì)胞壁形成。植物中MYB類轉(zhuǎn)錄因子主要以R2R3-MYB的形式存在，主要參與植物初生和次生代謝以及對(duì)外界刺激和脅迫的應(yīng)答過程。在模式植物擬南芥中已鑒定出130多個(gè)R2R3-MYB基因。在Stracke等[16]的研究中，擬南芥的133個(gè)R2R3-MYB基因被劃分為24個(gè)亞類，其中第10亞類MYB10主要調(diào)控花青苷的合成代謝過程。近年來已有研究報(bào)道MYB轉(zhuǎn)錄因子在蘋果（Malus domestica）[17]、櫻桃（Prunus avium L.）[18]、草莓（Fragaria ananassa）[19]和葡萄（Vitis vinifera）[20]等果實(shí)的花青素合成中起關(guān)鍵調(diào)控作用。本研究從金煌芒芒果果肉中克隆得到MinMYB10基因，分析其結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，并且與其他物種R2R3-MYB家族成員在此區(qū)域高度保守，開放閱讀框?yàn)?37 bp，編碼278個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為31.60 ku，等電點(diǎn)為5.89，不穩(wěn)定指數(shù)為56.17，為不穩(wěn)定蛋白。

花青素（Anthocyanins）是一種天然的植物色素，對(duì)于植物組織器官呈色具有重要的影響。近年來對(duì)花青素的研究也有了一定進(jìn)展。Vimolma ngkang等[21]研究報(bào)道過量表達(dá)蘋果R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MdMYB3可以促進(jìn)煙草合成花青素和黃酮醇，使轉(zhuǎn)基因煙草的花色加深。在月季中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子RhMYBs4-1和RhMYBs6-1也均可促進(jìn)花青苷的合成[22]。本研究克隆的MinMYB10具有典型的R2R3結(jié)構(gòu)域，可推測(cè)其參與芒果果實(shí)花青素的合成過程，對(duì)芒果果實(shí)花青素合成相關(guān)基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析，有助于闡明花青素合成與代謝對(duì)芒果果實(shí)呈色的調(diào)控機(jī)理，并進(jìn)一步構(gòu)建了沉默表達(dá)載體和過表達(dá)載體，為更深入解析該基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

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