發(fā)光細菌法在農(nóng)藥污染毒性檢測中的應(yīng)用研究進展

韋淑穩(wěn)　董莉莎　張巖　裴義山　徐升

摘要發(fā)光細菌法具有反應(yīng)快速靈敏、低價高效、對環(huán)境友好等特點，常用于環(huán)境污染監(jiān)測。本文綜述了發(fā)光細菌法在農(nóng)藥污染毒性檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展，重點介紹了費氏弧菌、青?；【⒚髁涟l(fā)光桿菌在人工合成化學農(nóng)藥、生物農(nóng)藥單一毒性檢測以及在重金屬一農(nóng)藥聯(lián)合污染毒性檢測中的應(yīng)用，并提出了發(fā)光細菌法在農(nóng)藥與其他多重污染物毒性檢測中的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 發(fā)光細菌法;農(nóng)藥污染;毒性檢測

中圖分類號 TQ450.9

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）05-0121-04

1國內(nèi)外農(nóng)藥污染現(xiàn)狀

目前，世界上生產(chǎn)和使用的農(nóng)藥有幾千種，生產(chǎn)上每年要使用約350萬t的農(nóng)藥，并以10%左右的速度遞增。其中，中國、美國、阿根廷占到了70%;僅中國就約占總量的50%，成為世界第一生產(chǎn)和出口大國。我國農(nóng)藥生產(chǎn)主要集中在江蘇浙江、天津、山東等?。ㄊ校?，其中江蘇、浙江的農(nóng)藥產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的1/3以上，農(nóng)藥使用量較大的是山東、江蘇、廣東、浙江等省。農(nóng)藥施用后，僅有30%左右附著于植物體上，或滲入植株體內(nèi)殘留下來，使糧、菜、水果等受到污染;其余70%左右散落在土壤上，或蒸發(fā)、散逸到空氣中，或隨雨水及農(nóng)田排水流入河湖，污染水體和水生生物，經(jīng)食物鏈最終進入人體，引起各種慢性或急性病害，嚴重危害人體健康。2015年以來，農(nóng)業(yè)部開展化肥、農(nóng)藥使用量零增長行動，每年安排逾40億元專項資金，堅持“產(chǎn)出來”“管出來"兩手抓、兩手硬，切實提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平，強化投人品管理，提升綠色生產(chǎn)水平。在加強農(nóng)藥、獸藥等投入品生產(chǎn)銷售管理的同時，進一步強化安全用藥指導服務(wù)，有效控制殘留超標，消除風險隱患。

2發(fā)光細菌的分類及其毒性檢測原理

2.1發(fā)光細菌的分類

發(fā)光細菌是一種非致病性、能進行生物發(fā)光的細菌，多數(shù)為海生，與發(fā)光浮游生物相同，能引起海面發(fā)光。發(fā)光細菌有傳統(tǒng)分類、系統(tǒng)分類、數(shù)值分類等幾種不同的分類方法。目前，多以美國學者P.Baumann的分類方法進行劃分，分為弧菌屬、發(fā)光桿菌屬和發(fā)光異短桿菌屬"。

2.2發(fā)光細菌法毒性檢測原理

正常條件下，發(fā)光細菌能發(fā)出肉眼可見熒光，響應(yīng)波長為450-490nm。發(fā)光菌形態(tài)多種多樣，但生理特性卻非常相似，發(fā)光機理基本相同。發(fā)光細菌含有熒光素熒光酶ATP等發(fā)光要素，在有氧條件下由分子氧作用，胞內(nèi)熒光酶催化，將還原態(tài)的黃素單核苷酸（FMNH2）、長鏈脂肪醛氧化為FMN、長鏈脂肪酸，同時釋放出最大發(fā)光強度在波長為450～490nm處的可見藍綠光。

當細胞活性升高、處于積極分裂狀態(tài)時，其ATP含量高，發(fā)光強度增強;而毒性物質(zhì)的存在會直接抑制參與發(fā)光反應(yīng)的酶類活性，并抑制細胞內(nèi)與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的代謝過程，抑制發(fā)光，且毒性越強抑制效果越明顯。在一定的試驗條件下，發(fā)光細菌發(fā)光強度恒定，發(fā)光變化的程度與受試物的濃度在一定范圍內(nèi)呈相關(guān)關(guān)系，同時與該物質(zhì)的毒性大小有關(guān)。大量的研究表明，用發(fā)光細菌檢測毒性的結(jié)果與魚類或小鼠毒性檢測的結(jié)果相比，其一致性較好，對污染物或毒性物質(zhì)的檢測試驗僅需15～60min，具有快速靈敏、低價高效、對環(huán)境友好等特點。對于能夠干擾或破壞發(fā)光細菌呼吸、生長、新陳代謝等生理過程的任何有毒物質(zhì)都可以根據(jù)發(fā)光強度的變化來測定，如重金屬、CN-、農(nóng)藥、酚類化合物、抗生素等。目前，國內(nèi)常用的3種發(fā)光細菌為明亮發(fā)光桿菌費氏弧菌、青?；【?。其中，應(yīng)用于農(nóng)藥污染毒性檢測中的主要發(fā)光細菌種類見表1。

3發(fā)光細菌法在農(nóng)藥污染毒性檢測中的應(yīng)用

3.1在人工合成化學農(nóng)藥污染毒性檢測中的應(yīng)用

3.1.1殺蟲劑。目前，中國殺蟲劑市場正面臨市場占比和使用量雙降的態(tài)勢，產(chǎn)品安全性環(huán)境友好性逐步提高，但殺蟲劑的用量及其對環(huán)境的影響依然是農(nóng)藥中最大的種類。張歡等采用青?；【鷥龈煞蹖Σ煌瑵舛绒r(nóng)藥敵敵畏溶液的毒性進行快速測試，試驗結(jié)果表明，系統(tǒng)的穩(wěn)定性、可重復(fù)性、準確性可達到甚至優(yōu)于傳統(tǒng)方法。袁東星等4通過激活凍干發(fā)光細菌粉對空心菜中6種有機磷農(nóng)藥乳劑（甲胺磷敵敵畏、辛硫磷、氧樂果、甲基異硫磷、水胺硫磷）進行檢測，響應(yīng)結(jié)果表明，發(fā)光強度與6種農(nóng)藥毒性均成負相關(guān)關(guān)系，檢出限約為1mg/L，測定下限為3mg/L，響應(yīng)曲線滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。吳淑杭等以明亮發(fā)光桿菌T3變種作為毒性測試物種，研究了樂果、殺蟲單等8種化學殺蟲劑急性毒性，結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，不同殺蟲劑對明亮發(fā)光桿菌的急性毒性不同，發(fā)光菌的相對發(fā)光率與殺蟲劑濃度成極好的線性負相關(guān);4種有機磷殺蟲劑乙酰甲胺磷、樂果敵敵畏與敵百蟲對明亮發(fā)光桿菌的ECo（15min）分別40.33、38.42、31.11、11.10mg/L，2種擬除蟲菊酯類殺蟲劑氰戊菊酯、高效氯氰菊酯ECso分別為23.56、14.63mg/L，噠螨靈和殺蟲單ECo分別為18.32、2.72mg/L，相較而言，有機磷殺蟲劑對發(fā)光菌的毒性更弱一些。修壘等6選取氯氰菊酯、敵敵畏2種農(nóng)藥作為污染檢測物，利用青?；【鶴67測定其對發(fā)光細菌的毒性影響，得出毒性大小為氯氰菊酯>敵敵畏，雖然測試菌種不同，但是2種農(nóng)藥對發(fā)光細菌的毒性大小與吳淑杭等研究結(jié)果相似。

在測試條件的研究方面，唐雪惠等叫以敵敵畏和氧化樂果為研究對象，采用以發(fā)光菌綜合毒性檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的在線毒性分析儀監(jiān)測有機磷類農(nóng)藥對水體的水質(zhì)毒性效果，結(jié)果表明，氧化樂果和敵敵畏均能引起明顯的毒性反應(yīng)，ECxo與ECso均為mg級，該在線毒性監(jiān)測儀更適用于突發(fā)性高濃度特征污染物的水質(zhì)預(yù)警。魏芳等8以明亮發(fā)光桿菌為菌種，以40%樂果乳劑為供試農(nóng)藥，不僅初步研究了農(nóng)藥毒性可檢測的濃度范圍及靈敏度，同時初步確定pH值為7條件下發(fā)光強度最強。

在土壤中農(nóng)藥的檢測研究中，張建江等以明亮發(fā)光桿菌作為測試菌種，對土壤中敵百蟲進行毒性測試得出發(fā)光菌的相對發(fā)光率與敵百蟲的濃度成負相關(guān)。張勝田等1以典型有機氯農(nóng)藥氯丹為研究對象，重點研究了氯丹在不同理化性質(zhì)土壤顆粒中的吸附特性及其對發(fā)光菌急性毒性的影響，研究結(jié)果表明，不同粒徑的土壤顆粒對氯丹的吸附性能依次為黏粒（<2μm）≈粉粒（2～20μum）>粗砂（200～2000pum）>細砂（20～200μm），4種土壤顆粒浸出液對發(fā)光菌毒性與吸附能力成負相關(guān)，較大粒徑（20～2000μm）土壤顆粒吸附氯丹后易于解吸，對發(fā)光菌的急性毒性最大。Jose Antonio等叫研究了2種廢棄礦井土壤的農(nóng)藥流動性和滲濾液毒性，發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥滲濾液對生物發(fā)光抑制的一般趨勢不像金屬濃度隨時間降低，而且污染土壤經(jīng)改良能輕微減輕對費氏弧菌的毒性，結(jié)果與農(nóng)藥淋出量減少趨勢一致。農(nóng)藥污染土壞滲濾液的毒性評估可以為化學分析提供有價值的補充信息，但目前我國尚缺乏以發(fā)光細菌為試驗對象對土壤中的有毒污染物進行測試的標準試驗方法。