超高效液相色譜-紫外法測定火龍果中多菌靈農(nóng)藥殘留

劉銘揚(yáng)　馮敏鈴　鄒學(xué)仁　張定煌　張益文

摘要建立了超高效液相色譜（UPLC）測定火龍果中多菌靈（MBC）殘留的快速分析方法，即火龍果樣品經(jīng)乙腈提取，NH2小柱凈化，紫外檢測器測定，外標(biāo)法定量。通過比較QuEChERS、NH2和MCX固相萃取柱凈化效果，對樣品前處理和色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，確定火龍果中多菌靈的檢測方法。結(jié)果表明，檢出限（SIN=3）為0.004mg/kg，方法定量限（S/N=10）為0.013mg/kg，多菌靈含量在0.02～1.00μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9998。添加量為0.02～0.20mg/kg時(shí)，平均回收率在80.6%～85.5%之間。該方法具有操作簡單、靈敏度高和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，適合火龍果中多菌靈檢測分析。

關(guān)鍵詞 火龍果;多茵靈;超高效液相色譜;紫外檢測器;NH2小柱

中圖分類號(hào) S667;S481*.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）05-0107-02

火龍果味道香甜，且具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，集“水果”“花卉”“保健”“醫(yī)用”為一體，被稱為神仙果?；瘕埞墓麑?shí)除可直接食用外，還可以進(jìn)行深加工，如火龍果酒、火龍果花醋、火龍果食用色素、火龍果水果罐頭等1-21。由于中山市氣候適合火龍果種植且能獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益，所以中山市家庭農(nóng)場都有大面積種植火龍果?；瘕埞菀资懿【腥?，需要對果園土壤殺菌消毒，而多菌靈是火龍果生產(chǎn)中使用的主要除菌農(nóng)藥。因此，多菌靈農(nóng)藥殘留也是當(dāng)前火龍果種植中存在的主要問題之一。

食品安全一直是歐美發(fā)達(dá)國家重視的問題，尤其對農(nóng)殘、獸殘和重金屬等要求日趨嚴(yán)格。多菌靈又名苯并咪唑44號(hào)、棉萎靈，化學(xué)名N一（2-苯并咪唑基）一氨基甲酸甲酯，是一種低毒高效、廣譜抗植物真菌藥，廣泛應(yīng)用于水果中病菌感染的防治3-7。當(dāng)?shù)剞r(nóng)民常用多菌靈預(yù)防火龍果炭疽病，很多大型農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場和農(nóng)檢站的農(nóng)殘快速試劑盒不能檢測水果中的多菌靈。當(dāng)前使用LC/MS檢測多菌靈具有靈敏度高、定性和定量準(zhǔn)等優(yōu)勢，但是LC/MS價(jià)格昂貴，尚未在基層農(nóng)檢站普及使用，所以使用超高效液相色譜儀檢測多菌靈仍是當(dāng)前最有效的方法之一。本方法通過優(yōu)化樣品前處理過程、選擇合適的固相萃取小柱凈化，以達(dá)到回收率高、靈敏度高的要求。采用UPLC檢測，流動(dòng)相為甲醇+水（體積比為30：70），色譜柱為AgilentEC-C18（4.6x150mm，2.7μm），多菌靈保留時(shí)間為2.597min，出峰時(shí)間快，能快速檢測，滿足大批量水果樣品檢測多菌靈的需求。

1材料與方法

1.1材料及試劑

試驗(yàn)所用火龍果均購于中山市附近家庭農(nóng)場。

供試藥劑：多菌靈（DR）;乙腈、甲醇、二氯甲烷（色譜級）;鹽酸、無水硫酸鈉、無水氯化鈉、氨水（GR）。

1.2儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（Waters?Acquity）;電子天平（METTL ER?TOLEDO）;振蕩搖床（IKAKS501）;旋渦混合器（IKAVO-RTEX2）;水浴氮吹儀（Biotage5?T250）;冷凍離心機(jī)（ThermoST40）;超純水機(jī)（ELGA?CLXXXUVM2）;加速溶劑萃取ASE（DIONEX?ASE100）;固相萃取柱：NH2小柱（Agilent500mg，6mL，12256045）;QuEChERS（Dispersive?SPE，5982-5056）;MCX小柱（Waters150mg，6mL，186000256）。

1.3試驗(yàn)方法

13.1樣品前處理。將火龍果去除葉冠部分，切碎混合均勻，按四分法縮分，置于食品攪拌機(jī)中打漿，取500g用塑料樣品瓶-18C密封保存。準(zhǔn)確稱取火龍果樣品10g（精確至0.01g）于50mL康寧離心管中，加入5g無水氯化鈉和無水硫酸鈉，加入一個(gè)陶瓷均質(zhì)子（防止樣品結(jié)塊），再加入20mL乙腈，蓋上離心管蓋子，超聲提取5min后，放人搖床圓周振蕩30min后取出。放人離心機(jī)，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心4min，使乙腈與飽和食鹽水分層。吸取5mL上清液于試管中，放入40C氮吹儀吹干，待用。加入2mL甲醇+二氯甲烷（體積比5：95）吹至近干的試管中，漩渦1min。用5mL甲醇+二氯甲烷（體積比5：95）預(yù)淋洗NH2小柱，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱子填料表面時(shí)，關(guān)閉固相萃取裝置開關(guān)，棄去預(yù)洗液，保證小柱不斷流，迅速加入2mL殘?jiān)芙庖?，再?mL甲醇+二氯甲烷（體積比5：95）旋渦提取殘?jiān)?，重?fù)1次，擠干，收集。40C水浴氮吹儀吹至近干后，用1mL甲醇定容，經(jīng)0.22um有機(jī)相濾膜過濾于樣品瓶中，待測。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。稱量（精確至0.01mg）多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容，配制濃度為1000μg/mL多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18C棕色樣品瓶保存，有效期為1年。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制，通過逐級稀釋，配制1μg/mL工作液，最后用基質(zhì)稀釋，配制多菌靈濃度分別為0.02、0.05.0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL。1.3.3儀器條件。色譜柱為AgilentEC-C18（4.6x150mm，2.7μm）;流動(dòng)相為甲醇：水（V/V）=30：70;流速為0.4mL/min;檢測器為TUV;檢測波長為286nm;進(jìn)樣量為10μL;柱溫為30C。

2結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)相選擇

分別試驗(yàn)了甲醇+水（體積比30：70）、甲醇+水（體積比40：60）、乙腈+水（體積比30：70）、乙腈+水（體積比40：60）作為流動(dòng)相對多菌靈的分離效果結(jié)果表明，上述幾種不同配比的流動(dòng)相都能有效從火龍果基質(zhì)中分離出多菌靈，但綜合試驗(yàn)對環(huán)境因素和人的影響，選擇毒性相對較小、價(jià)格便宜且配制過程更簡單的甲醇+水（體積比30：70）作為流動(dòng)相。多菌靈在火龍果基質(zhì)中的超高效液相色譜見圖1。

2.2提取溶劑的選擇

根據(jù)相似相容原則，本試驗(yàn)選擇乙腈、乙醚和乙酸乙酯作為農(nóng)藥提取劑進(jìn)行比較。結(jié)果表明，乙腈提取的顏色最淺，且回收率最高，而且，乙腈是實(shí)驗(yàn)室常用試劑，所以本試驗(yàn)最終選擇回收率最好、提取雜質(zhì)更少的乙腈為提取溶劑。

2.3固相萃取小柱的選擇

試驗(yàn)分別對比了MCX和NH2小柱的凈化效果和回收率，通過加標(biāo)回收試驗(yàn)將NH2與MCX小柱進(jìn)行對比，同時(shí)每種小柱做3個(gè)添加濃度（0.02、0.04、0.20mg/kg），共6個(gè)平行試驗(yàn)，綜合價(jià)格、平均回收率凈化效果等因素選擇凈化柱。其中，NH2小柱凈化方法做了3個(gè)配比淋洗液，即甲醇+二氯甲烷（體積比1：99）、甲醇+二氯甲烷（體積比5：95）、甲醇+二氯甲烷（體積比10：90）作為比較，選擇凈化效果最好、回收率最高的淋洗液。

MCX小柱：加入0.1mol/L鹽酸5mL于吹干的試管中，漩渦溶解殘?jiān)?min后，分別加人5mL甲醇和5mL水預(yù)淋洗MCX小柱，加入0.1mol/L鹽酸1mL先使其酸化，保證待測物保留在MCX小柱填料中，迅速加入5mL殘?jiān)芙庖?，再?mL水、5mL甲醇淋洗，不收集，關(guān)閉固相萃取裝置開關(guān)，棄去廢液，凈化過程中保證小柱不斷流。向固相萃取裝置中加入試管收集，用3mL5%氨水一甲醇溶液淋洗小柱，重復(fù)1次，洗耳球吹干，收集并在40C氮吹儀吹至近干后，用1mL甲醇定容，過0.22μm有機(jī)相濾膜于樣品瓶中，待測。

結(jié)果表明，使用甲醇+二氯甲烷（體積比1：99）淋洗NH2小柱平均回收率接近55%;使用甲醇+二氯甲烷（體積比5：95）淋洗NH2小柱平均回收率接近85%;使用甲醇+二氯甲烷（體積比10：90）淋洗NH2小柱平均回收率接近80%，但雜質(zhì)多，會(huì)影響目標(biāo)峰;MCX小柱平均回收率則接近90%。最終綜合考慮價(jià)格、凈化效果、回收率，選擇了甲醇+二氯甲烷（體積比5：95）淋洗NH2小柱為前處理凈化方法。

2.4QuEChERS與固相萃取小柱凈化的比較

QuEChERS是未來檢測發(fā)展的趨勢，現(xiàn)主要用于水果中農(nóng)藥快速提取和凈化色素等雜質(zhì)1812。對比試驗(yàn)如下：準(zhǔn)確稱取火龍果樣品10g（精確至0.01g）于50mL離心管中，依次加入5g無水氯化鈉.5g無水硫酸鈉、20mL乙腈，放入陶瓷均質(zhì)子（防止樣品結(jié)塊），振蕩搖床上振搖30min取出，以8000r/min轉(zhuǎn)速離心4min。取出乙腈上層提取液15mL于DispersiveSPE管中，以5000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，吸取上清液5mL，吹干定容1mL，過0.22μm有機(jī)相濾膜于樣品中，待測。

試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)QuEChERS方法前處理后，用超高效液相色譜分析，干擾物質(zhì)較多，樣品中基質(zhì)峰干擾較大，容易出現(xiàn)假陽性峰，不能準(zhǔn)確地定性、定量。QuEChERS方法雖然前處理簡單，凈化后多用于質(zhì)譜分析，但由于質(zhì)譜普遍價(jià)格昂貴維護(hù)成本高、操作難度大等尚未在基層普及。因此，本試驗(yàn)選用超高效液相色譜法測定，經(jīng)固相萃取小柱凈化，能夠很好地適用于超高效液相色譜上機(jī)分析。

2.5基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)干擾組分對分析物的濃度和質(zhì)量測定精確度起到干擾作用，稱為基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)不同，基質(zhì)效應(yīng)也存在很大的差異。因此，為了能去除基質(zhì)效應(yīng)，采用相同空白基質(zhì)配制工作曲線進(jìn)行定量，降低基質(zhì)效應(yīng)，增加定量的準(zhǔn)確性，減少假陽性誤判。

2.6方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

經(jīng)檢測分析，用不含目標(biāo)物的火龍果按照1.3.1方法凈化后，作為空白基質(zhì)，將多菌靈儲(chǔ)備液按照1.3.2進(jìn)行配制，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得線性方程y=79.34064x-1025.877，相關(guān)系數(shù)為0.9998。按本試驗(yàn)方法測定的結(jié)果，以3倍信噪比作為方法檢出限（S/N=3）為0.004mg/kg，10倍信噪比作為定量限（S/N=10）為0.013mg/kg。

2.7方法的精密度和準(zhǔn)確度

方法回收率是通過加標(biāo)回收試驗(yàn)實(shí)際值與理論值的比值計(jì)算，以不含多菌靈的火龍果添加3種不同濃度多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度做6個(gè)平行試驗(yàn)，同時(shí)做2個(gè)空白試驗(yàn)。平均回收率在80.6%～85.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3%～7.2%之間（表1）。說明該試驗(yàn)方法具有較高的回收率和較好的精密度，可以作為檢測火龍果中多菌靈的方法使用。

2.8實(shí)際樣品分析

選擇若干中山市家庭農(nóng)場，共采集30個(gè)火龍果樣品，按照本方法的儀器條件對火龍果樣品進(jìn)行分析。有5個(gè)火龍果樣品檢出多菌靈，但5個(gè)樣品的檢測結(jié)果均低于定量限0.02mg/kg，略高于檢出限0.004mg/kg。

3結(jié)論與討論

本文通過篩選提取劑、優(yōu)化樣品凈化等前處理方法，建立了超高效液相色譜法分析火龍果中多菌靈農(nóng)藥殘留。本方法采用超高效液相色譜法測定火龍果中的多菌靈，前處理采用乙腈提取、NH2小柱凈化，能有效地減少基質(zhì)干擾，靈敏度和精密度較高，適用于實(shí)際樣品檢測，能滿足火龍果樣品中多菌靈殘留快速篩查和批量檢測的工作需求。

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