抗CMV轉(zhuǎn)基因辣椒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法研究

羅阿東　王麗平　任艷玲　蔡秋　王艷

摘要針對(duì)辣椒中轉(zhuǎn)基因成分建立快速、高效、準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以縮短檢測(cè)周期，提高檢出率。結(jié)果表明，針對(duì)轉(zhuǎn)基因辣椒的內(nèi)源基因CaATLI和外源基因CMV建立的檢測(cè)方法，具有很好的特異性，二者檢測(cè)靈敏度均可達(dá)0.01%。本研究建立的檢測(cè)方法特異性、靈敏度和準(zhǔn)確度高，也比較方便快速，同時(shí)使用的是全部閉管操作，大大降低了普通PCR帶來的污染，為轉(zhuǎn)基因辣椒的檢測(cè)提供了新的檢驗(yàn)方法。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因辣椒;實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法;CaATLI基因;CMV基因

中圖分類號(hào) S641.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）05-0067-03

辣椒是人們生活中必不可少的蔬菜作物，具有藥理、經(jīng)濟(jì)、食用、營(yíng)養(yǎng)等方面的價(jià)值。我國(guó)辣椒制品種類繁多，如油辣椒、糟辣椒、辣椒醬等，辣椒制品的多樣化推動(dòng)了我國(guó)辣椒產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展辣椒在世界各地廣泛種植，但同時(shí)也面臨著連作障礙、土壤傳播疫病、生長(zhǎng)條件產(chǎn)量及質(zhì)量等諸多問題，人們借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及辣椒分子育種技術(shù)，對(duì)辣椒的生長(zhǎng)條件、栽培技術(shù)、病蟲害防治等方面進(jìn)行了研究。

隨著轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的大規(guī)模商業(yè)化，越來越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品被制作成為人類消費(fèi)的食品，轉(zhuǎn)基因食品在傳統(tǒng)食品市場(chǎng)中的份額正不斷加大，逐步走上餐桌，進(jìn)入人們的食物鏈。由于其安全性及對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境的潛在威脅受到國(guó)際社會(huì)和廣大民眾的廣泛關(guān)注B，作物轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)越來越受到重視。

目前，對(duì)于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)主要是針對(duì)重組DNA的核酸檢測(cè)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），包括定性PCR、多重PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR等。其中，實(shí)時(shí)熒光PCR作為目前主要的檢測(cè)方法，有效避免了普通PCR方法存在的檢測(cè)靈敏度不高、費(fèi)時(shí)且容易造成交叉污染等缺點(diǎn)，確保了檢測(cè)結(jié)果的快速、準(zhǔn)確。

本文通過應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)抗CMV（Cucumber?mosaic?virus，黃瓜花葉病毒）轉(zhuǎn)基因辣椒進(jìn)行檢測(cè)，旨在建立一種簡(jiǎn)便、快速的辣椒轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法，以期為消費(fèi)者食品安全及我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1材料。轉(zhuǎn)基因辣椒陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，非轉(zhuǎn)基因辣椒，非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻油菜籽、番茄。

1.1.2試劑。Premix?Ex Taq（Probeq?PCR）（熒光PCR反應(yīng)液）、MiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKit（DNA提取試劑）、引物及TaqMan探針，均購(gòu)買于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器。實(shí)時(shí)熒光PCR儀（7500Fast，美國(guó)Applied?Bio-systems）、高速冷凍離心機(jī)（Microfuge22R?Centrifuge，美國(guó)Beckman Coulter）、超純水儀（Milli?Q，美國(guó)Millipore）核酸蛋白測(cè)定儀（Nano?Drop2000，美國(guó)Thermo?Scientific）、冷凍研磨儀（MM400，德國(guó)Retsch）、移液器、渦旋振蕩器恒溫金屬浴、生物安全柜等。

1.1.4引物及探針。根據(jù)GenBank中轉(zhuǎn)基因辣椒的CaATLI（Capsicumannum?AT-hooklgene，編碼辣椒AT一hook1蛋白基因）和CMV基因序列，利用Primer?Express軟件設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針序列，弓物和探針序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1，探針和引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取。取2%CTAB抽提緩沖液于65C金屬浴中預(yù)熱，取樣品約0.3g置于冷凍研磨儀（液氮處理）研磨，加入2%CTAB抽提緩沖液700μL，輕輕攪動(dòng)，將磨碎液倒人1.5mL滅菌離心管中，于65C金屬浴加熱振蕩10min，加人5mol/L醋酸鉀溶液5μL，混勻，再金屬浴20min;取出離心管后放置在冰上，加人等體積的氯仿/異戊醇（24：1），輕輕來回顛倒，充分混勻;然后放人4C高速冷凍離心機(jī)中（12000r/min）離心15min，吸取上清液500μL放入另一離心管中，加入等體積的異戊醇，顛倒混勻;12000r/min離心10min后，棄上清，加入75%乙醇500μL，輕彈離心管，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置30min，使DNA塊狀物上的不純物溶解;12000r/min離心5min后棄去上清，加入等量75%乙醇再洗30min，12000r/min離心5min后，棄上清液，并將離心管倒立于濾紙之上，自然風(fēng)干，加入50μLTE溶液，使DNA溶解，利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定樣品DNA的OD260與OD280，其余于-20C冰箱冷凍保存待用。1.2.2熒光PCR反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)熒光PCR使用商品化專用熒光PCR反應(yīng)液PremixExTaqP（內(nèi)含經(jīng)優(yōu)化過的Taq酶、Mg*、dNTP）;反應(yīng)體系中的引物和TaqMan探t使用推薦濃度，具體見表2。

1.2.3熒光PCR反應(yīng)程序。根據(jù)引物及TaqMan探針Tm值，確定熒光PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)程序，見表3。

1.2.4特異性試驗(yàn)。以轉(zhuǎn)基因辣椒陽性標(biāo)準(zhǔn)品以及非轉(zhuǎn)基因辣椒、玉米、大豆、水稻、油菜籽、番茄的基因組DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，確定內(nèi)源基因引物CaATLI和外源基因引物CMV的特異性。

1.2.5靈敏度試驗(yàn)。測(cè)定轉(zhuǎn)基因辣椒陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度，并對(duì)其進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋10個(gè)梯度，將稀釋液用上述反應(yīng)體系和程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，確定檢測(cè)靈敏度。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果

提取樣品總DNA，利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定樣品DNA的濃度與純度，DNA質(zhì)量濃度可以達(dá)到100～200ng/uL，OD2x/OD280值在1.6～1.8之間，均達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)對(duì)DNA進(jìn)行分析的要求。

2.2特異性試驗(yàn)結(jié)果

以轉(zhuǎn)基因辣椒陽性標(biāo)準(zhǔn)品以及非轉(zhuǎn)基因辣椒、玉米、大豆、水稻油菜籽、番茄的基因組DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

由圖1可知，針對(duì)內(nèi)源基因CaATLI，只有轉(zhuǎn)基因辣椒陽性標(biāo)準(zhǔn)品和非轉(zhuǎn)基因辣椒有明顯擴(kuò)增曲線，而其他對(duì)照物則無擴(kuò)增曲線;針對(duì)外源基因CMV，只有轉(zhuǎn)基因辣椒陽性標(biāo)準(zhǔn)品有明顯擴(kuò)增曲線，其余對(duì)照物則沒有。結(jié)果表明，針對(duì)內(nèi)源基因CaATLI和外源基因CMV的檢測(cè)引物和探針具有較好的特異性。

2..3靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度為240ng/μL，并對(duì)其進(jìn)行10倍梯度稀釋，用上述反應(yīng)體系和程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，確定檢測(cè)靈敏度。

由圖2可知，內(nèi)源基因CaATLI和外源基因CMV到了10-5稀釋度（0.01%）仍然可以檢測(cè)出來，形成典型的“S"形擴(kuò)增曲線。其中，內(nèi)源基因CaATLI在106稀釋度有非典型的擴(kuò)增曲線（CT值>35），在進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)試后，發(fā)現(xiàn)10-6稀釋度擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)不穩(wěn)定態(tài)勢(shì)，表明該稀釋度下的DNA含量極低，已達(dá)到方法檢測(cè)極限，容易出現(xiàn)波動(dòng)，故將其靈敏度取10-5稀釋度（0.01%）。

3結(jié)論與討論

在分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)上，判斷DNA純度的依據(jù)是OD20/OD280的比值，符合要求純度高的純化DNA其0D260/OD20在1.7～1.9之間，低于此范圍表示所提取的樣品DNA中含有蛋白質(zhì)污染，高于此范圍表明樣品DNA中有RNA.污染。提取的辣椒樣品DNA中存在著較多的多酚、多糖，也是導(dǎo)致0D26/OD280比值偏低的原因之一。因此，在操作的過程中，需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。

特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)辣椒內(nèi)源基因CaATLI和外源基因CMV的檢測(cè)引物和探針具有較好的特異性;靈敏度測(cè)試結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因辣椒實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度小于0.01%。目前，國(guó)際上設(shè)定的轉(zhuǎn)基因限量大多為1%，是本方法檢測(cè)靈敏度的100倍，認(rèn)為0.01%的檢測(cè)靈敏度已完全能夠滿足基因檢測(cè)的需要。

4參考文獻(xiàn)

[1]康瑜，肖深根，李穎.辣椒轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].辣椒雜志，2012（2）：6-11.

[2]田婭紅，張鼎華.植物轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展及安全性分析[J].廊坊師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014（4）：89-93.

[3]覃乾.轉(zhuǎn)基因人類的一場(chǎng)大賭局[J].中國(guó)新時(shí)代，2012（5）：96-97.

[4]徐穎.轉(zhuǎn)基因大米的安全性與核酸檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（33）：16240-16242.

[5]丁超.辣椒煙草花葉病毒的分子鑒定及檢測(cè)技術(shù)研究[D].貴陽：貴州師范大學(xué)，2017.

[6]王鳳軍，葉素丹，包永華，等.多重實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2018（9）：135-141.

[7]辛艷，劉何，常雪艷，等.農(nóng)作物種子轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR盲檢技術(shù)要點(diǎn)與應(yīng)用[J].天津農(nóng)林科技，2018（1）：35-38.

[8] MEL' NICHUK M D，DUBIN A V ，SYTNIK S K，et al.ldentification and?localization of virus RNA in pepper（ Capsicum anum L. ）chloroplasts by?means of the PCR method[J].Mikrobiol Z， 2003 ， 65（3）：54- -59.

[9]楊中周.分子標(biāo)記技術(shù)在辣椒種子純度檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)瓜菜，2015（3）：1-4.

[10]桑維維，高貴珍，張興桃，等.辣椒基因組DNA兩種提取方法的比較[D].宿州學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（8）：21-24.