外源水楊酸對(duì)日本落葉松幾種主要防御蛋白活力的影響

陳詠梅，彭飛飛，林健

(湖北民族大學(xué)，湖北 恩施 445000)

誘導(dǎo)抗性是指植物在遇到損傷、捕食、外源信號(hào)化合物等外界因素的誘導(dǎo)下，能影響植食者行為或降低其偏好的反應(yīng)[1]，誘導(dǎo)抗蟲性是指植物在植食昆蟲攝取后表現(xiàn)出的一種抗蟲特性[2]。目前已發(fā)現(xiàn)多種生物和非生物因子通過誘導(dǎo)植物部分或整株產(chǎn)生有毒的次生物質(zhì)、防御蛋白、驅(qū)避性物質(zhì)，或改變自身營養(yǎng)狀態(tài)，或產(chǎn)生吸引天敵的揮發(fā)物等，從而使其免害或避害，達(dá)到抗蟲、防御的目的[3]。苯丙氨酸解氨酶(phenylanlanine ammonia-lyase, PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是植物體內(nèi)主要防御性酶，過氧化氫酶(Catalase, CAT)、過氧化物酶(Peroxidae, POD)是植物體內(nèi)主要保護(hù)性酶，它們作為植物體內(nèi)關(guān)鍵的防御蛋白，與植物抗性緊密關(guān)聯(lián)[4]。馬榮金[5]等對(duì)不同黃瓜品種的抗性研究表明，植物的抗性與PAL、PPO的活性密切相關(guān)，植物細(xì)胞為應(yīng)對(duì)外界脅迫而激活其PAL活性，表明酶活性與植物抗蟲能力密切相關(guān)[6]。

水楊酸( salicylic acid, SA)是植物體內(nèi)常見的一種小分子酚類物質(zhì)[7]，其不僅能調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育，還在植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗性中起重要作用[8]。日本落葉松(Larixkaempferi)，姿態(tài)優(yōu)美，葉色翠綠，生長初期較快，木材機(jī)械性能好，是中山地帶造林的優(yōu)良樹種，其引種栽培，不僅對(duì)國內(nèi)木材供應(yīng)、城市綠化等方面產(chǎn)生重大影響，而且具有較高的生態(tài)價(jià)值[9]。隨著日本落葉松在我國種植面積的不斷增大，其病蟲害防治也應(yīng)加大力度，目前對(duì)日本落葉松蟲害的研究較少且缺乏系統(tǒng)性。鑒于此，本研究以不同濃度梯度的SA處理日本落葉松并測(cè)定針葉內(nèi)主要防御蛋白活力變化，探討不同濃度水楊酸對(duì)日本落葉松誘導(dǎo)抗性的影響，為有效防治落葉松球蚜和誘導(dǎo)抗蟲性機(jī)制研究提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于恩施州建始長嶺崗林場(chǎng)，林場(chǎng)地處鄂西建始縣龍坪鄉(xiāng)，中心位置30°48′ N、110°03′ E，海拔1 600～1 900 m，屬北亞熱帶氣候，是國家林木良種基地，建有南方日本落葉松種子園，該縣是中國南方最大的日本落葉松基地縣[10]。2018年5月初，于試驗(yàn)苗圃地選取2000株2年生日本落葉松苗，自然條件下培育待用。7月末，將水楊酸配制成3種濃度的溶液對(duì)苗木進(jìn)行誘導(dǎo)處理，對(duì)照噴施等量溶劑，每處理組150株。詳見表1。

表1 外源水楊酸對(duì)日本落葉松的處理

處理后第1、3、5和7天進(jìn)行落葉松針葉采集取樣。取樣時(shí)，在每株各方位上摘取完整的針葉，并充分混合均勻。每個(gè)處理采集16株，每4株為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)摘取30 g新鮮針葉。新鮮針葉立即進(jìn)行液氮冷凍并置于冰箱冷凍保存待用。

1.2 儀器與試劑

儀器：D-37520冷凍離心機(jī)(德國)、電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、UV-240紫外分光光度計(jì)(Biochtom Ltd. Cambridge CB4 OF J. England)、電子天平(奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司)、可調(diào)式移液器(上海雷勃分析儀器有限公司)。

試劑：PAL、PPO、CAT、POD試劑盒，均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.3 酶活力測(cè)定方法

取適量日本落葉松針葉鮮樣進(jìn)行液氮粗磨，后準(zhǔn)確稱取日本落葉松針粗磨樣品0.1 g，低溫保存?zhèn)溆谩Ｃ富盍y(cè)定均按照試劑盒說明書操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS24.0軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析；差異顯著性檢驗(yàn)采用LSD、鄧肯法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理4種酶活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖1不同處理4種酶活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

由圖1可知，相對(duì)CK，不同濃度的SA處理后，PAL、PPO、POD活性均顯著上升，并呈現(xiàn)先上升后下降的波動(dòng)性變化；而CAT活性在處理后呈現(xiàn)先下降后回升的波動(dòng)性變化，但未發(fā)現(xiàn)其與濃度呈現(xiàn)明顯的依賴關(guān)系。

2.1.1 不同濃度SA對(duì)日本落葉松針葉內(nèi)防御性蛋白活性的影響

圖2不同濃度SA對(duì)日本落葉松針葉內(nèi)防御性酶活性的時(shí)序變化

注：上圖同一天中柱形圖上不同小寫字母表示在P=0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示在P=0.01水平上差異顯著；相同則表示差異不顯著。以下同

由圖2可知，不同濃度SA處理后的PAL、PPO活性顯著高于CK，且在不同濃度梯度之間活性差異顯著，其中SA0.1濃度下PAL活性最高、SA0.01濃度下PPO活性最高。

PAL活性，在SA0.01處理后，第1天及第3天時(shí)與CK差異極顯著，第5天時(shí)與CK差異顯著，第7天時(shí)與CK差異不顯著；SA0.1處理在各時(shí)間段均與CK差異極顯著；SA1處理僅在第1天時(shí)酶活性顯著高于SA0.01和SA1處理CK。

PPO活性，在各濃度SA處理后，第1天均與CK差異不顯著，第3天、5天、7天均與CK差異顯著；SA0.01處理酶活性在第5天、7天均顯著高于SA0.1和SA1處理。

2.1.2 不同濃度SA對(duì)日本落葉松針葉內(nèi)保護(hù)性蛋白活性的影響

圖3不同濃度SA對(duì)日本落葉松針葉內(nèi)保護(hù)性酶活性的時(shí)序變化

由圖3可知，CAT活性，在不同濃度SA處理后，均呈現(xiàn)先下降后上升的態(tài)勢(shì)，且在不同濃度梯度之間活性差異不顯著；各濃度處理在第1、7天時(shí)與CK差異不顯著，而在第3、5天時(shí)與CK表現(xiàn)出顯著差異。

POD活性，在SA0.01處理后，第1～7天均與CK差異極顯著；SA0.1在第5天時(shí)與CK差異極顯著，其余天數(shù)與CK差異顯著；SA1處理除第7天外，其余天數(shù)均與CK差異極顯著，且SA1處理在第1天后活性呈下降趨勢(shì)；除第1天外，SA0.01處理酶活性均顯著高于SA0.1和SA1。

3 結(jié)論與討論

誘導(dǎo)抗性是植物非常重要的防御措施，具有非常復(fù)雜的適應(yīng)可塑性[11]。相較于植物固有的組成抗性，誘導(dǎo)抗性是一種更為經(jīng)濟(jì)有效的防御機(jī)制[12]。PAL、PPO、CAT和POD與植物的防御抗性密切相關(guān)，常作為衡量植株抗性水平的關(guān)鍵酶，其活性改變預(yù)示著植物化學(xué)防御體系正在發(fā)生改變[13]。本研究表明，外源SA噴施后，日本落葉松內(nèi)PAL、PPO、POD活性均顯著增加，其中0.1 mmol·L-1的SA溶液對(duì)PAL活性的誘導(dǎo)效果最佳，0.01 mmol·L-1的SA溶液對(duì)PPO和POD活性的誘導(dǎo)效果最佳且酶活性持續(xù)時(shí)間長；而CAT活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這與劉鳳權(quán)和原永兵[14，15]研究結(jié)果一致，表明外源SA能迅速誘導(dǎo)日本落葉松針葉內(nèi)防御物質(zhì)的表達(dá)和積累，提高日本落葉松的抗蟲性。

研究外源水楊酸與植物防御之間的關(guān)系為害蟲治理和抗蟲植物培育提供了新的思路。本研究表明，SA能夠在保持植株完好的情況下，誘導(dǎo)植物防御蛋白的變化，其作為植物抗蟲誘導(dǎo)劑，具有高效、環(huán)保、可持續(xù)等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)林木害蟲綠色防治，為探索環(huán)境友善型害蟲防治技術(shù)奠定基礎(chǔ)。但本試驗(yàn)僅作為一種基礎(chǔ)性的研究，為日本落葉松誘導(dǎo)抗性提供實(shí)踐和理論基礎(chǔ)，后期可進(jìn)行SA溶液緩釋處理、控制酶活性的基因及處理后的針葉內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，使外源SA誘導(dǎo)日本落葉松抗性增強(qiáng)技術(shù)能在林間綜合治理中得到有效應(yīng)用。