桑根酮C體內(nèi)外抗腫瘤作用研究

王藝，李妍，謝天平，王喆，張梅

(石河子大學(xué)藥學(xué)院藥理系,新疆 石河子 832000)

癌癥，是嚴(yán)重危害人類健康、導(dǎo)致現(xiàn)代人類死亡的第一大惡疾和頑癥。世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示，在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤的死亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。據(jù)聯(lián)合國統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2014年全球平均每8個死亡病例中就有1人死于癌癥，這比艾滋病、結(jié)核病和瘧疾導(dǎo)致的死亡人數(shù)總和還要高，每年全球還有1000多萬人被確診患上癌癥。近20年，我國的惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，目前國內(nèi)多數(shù)醫(yī)院收治的腫瘤患者中，以中晚期居多，并且治愈率較低,死亡率高，給我國的社會和醫(yī)療帶來沉重的負擔(dān)。雖然對細胞癌變的機制的認識在不斷深入，然而人們在控制癌癥的征途中步履維艱，進展緩慢，人類將面臨著防治惡性腫瘤的新挑戰(zhàn)。因此,實現(xiàn)癌癥的早期診斷對于有效治療和改善預(yù)后轉(zhuǎn)歸尤為重要[1]。尋找新的抗癌藥物和探討其分子機制是目前癌癥防治措施研究的重點。

很多研究都證實，桑樹中抗癌主要成分是黃酮類化合物，這些黃酮類化合物中，桑根酮C(Sanggenon C)含量較高。目前桑根酮C藥理學(xué)研究被證實具有明顯的降壓、抗炎作用，但其抗癌作用方面研究鮮有報道。國外僅研究了桑根酮C對PKC、ODC和COX-1等癌癥相關(guān)因子有抑制作用[2-4]，而國內(nèi)目前主要研究其提取工藝[5]。在國內(nèi)外研究的基礎(chǔ)之上，本文研究了桑根酮 C體內(nèi)體外抗腫瘤作用，旨在探究桑樹中抗癌活性成分，為臨床癌癥治療提供手段和理論依據(jù)，為新疆藥用植物桑的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

桑根酮C(SC,寶雞市辰光生物科技有限公司)，5-氟尿嘧啶(美侖生物)，1640(HyClone)，PBS，0.4%SRB溶液，胰蛋白酶(BOSTRE)，B16F0細胞、B16F10細胞、HepG2細胞、小鼠肝癌細胞H22由石河子大學(xué)藥學(xué)院藥理系提供,昆明種小鼠由石河子大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 細胞培養(yǎng)

B16F0細胞、B16F10細胞、HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%的雙抗RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞增殖測定

1×104個腫瘤細胞(B16F0細胞、B16F10細胞、HepG2細胞)接種于96孔板內(nèi)，24 h后，用不同濃度的桑根酮C (5、10、20、40、80 μmol/L)處理腫瘤細胞48 h。采用SRB法檢測細胞增殖的變化。

1.4 黑色素含量的測定

接種對數(shù)生長期的B16F0、B16F10細胞以每孔1.0×105鋪于6孔板，加入B16F0的SC終濃度為20、40、80 μmol/L；加入B16F10的SC終濃度為60、80、100 μmol/L。桑根酮C處理細胞24 h，收集細胞于離心管內(nèi)，用PBS洗一次一并倒入離心管，3500 r/min離心5 min，收集上清液,取1 mL上清液加入1 mL 0.4 mol/L HEPES buffer (pH 6.8)和1 mL溶液(乙醚∶乙醇=1∶1)。取下層水相于96孔板內(nèi)，每組5個平行孔。細胞沉淀計數(shù)后加入含10%DMSO-NaOH 1.5 mL于80 ℃煮1 h, 3 500 r/min離心10 min,取上清液鋪96孔板，每組5個平行孔。在405 nm波長下測定吸光度(A)，計算黑色素含量。

1.5 對小鼠肝癌細胞移植動物腫瘤生長和臟器指數(shù)的影響

取昆明小白鼠，制備H22小鼠肝癌細胞懸液，每只小鼠腋窩皮下接種2×106/mL的細胞懸液(0.2 mL/只)，將實驗動物隨機分成5組，分別為模型組、5-FU(20 mg/kg)陽性對照組、桑根酮C的低 (12.5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)3個劑量組。

在接種后第1天開始，均采取腹腔注射給藥，連續(xù)處理10 d。末次給藥24 h后，處死動物，剝離瘤組織并稱重，剝?nèi)⌒?、肝、腎、脾等臟器并稱重，計算抑瘤率和臟器指數(shù)變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細胞增殖抑制作用

5～80 μmol/L的桑根酮C有明顯抑制B16F0、B16F10、HepG2細胞增殖作用(圖1)，尤其抑制HepG2作用最為明顯，細胞的IC50值分別為59.08±0.04、130.17±0.03、50.58±0.03 μmol/L。由結(jié)果可知，HepG2細胞對桑根酮C最敏感。

注：與空白組比較, * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001圖1 桑根酮C抑制細胞增殖Fig.1 The proliferative inhibition of sanggenon C on cancer cells n=3)

2.2 細胞內(nèi)、外黑色素含量的測定

當(dāng)B16F0與SC作用時，與未加藥的B16F0細胞對比，20、40、80 μmol/L的SC能使B16F0細胞黑色素生成增加，且呈劑量依賴性(圖2)。細胞外黑色素含量與對照組相比，分別為對照組的2.43±0.06倍，3.72±0.03倍，6.74±0.07倍；細胞內(nèi)黑色素含量與對照組相比，分別為對照組的3.10±0.40倍，3.95±0.46倍，7.92±0.89倍。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算，20、40、80 μmol/L藥物處理組較未加藥組有極顯著性差異(P<0.01)。

相同濃度的SC作用于B16F10細胞后，與未加藥的B16F10細胞對比，SC能使B16F10細胞黑色素生成增加，且呈劑量依賴性(圖2)。細胞外黑色素含量與對照組相比，分別為對照組的1.22±0.03、1.90±0.01、4.26±0.09倍；細胞內(nèi)黑色素含量與對照組相比，分別約為對照組的1.18±0.04、1.50±0.03、1.97±0.03倍。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，80、100 μmol/L組較未加藥組有極顯著性差異(P<0.01)，60 μmol/L組較未加藥組有顯著性差異(P<0.05)。

注：與空白組比較, *P<0.05, ** P<0.01圖2 桑根酮C抑制細胞增殖Fig.2 Effect of SC on melanin levels in cancer cells n=3)

2.3 桑根酮C抑制小鼠H22移植瘤的生長

建立小鼠H22腫瘤模型,腹腔注射給藥，給藥期間小鼠對藥物耐受性良好，體重變化不大。

桑根酮C各組小鼠體重與空白對照組相比無顯著性差異，表明桑根酮C對小鼠的生長無明顯影響(表1)。

桑根酮C高中低3個劑量組均對H22荷瘤小鼠腫瘤生長產(chǎn)生抑制作用，抑制率為35.01%～47.65%，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)，且在該劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(圖3)。

表1 桑根酮C對荷瘤小鼠體重和瘤重的影響Tab.1 The effect of Sangenone C on the tumor growth and body weight of H22 mice

注：與對照組比較，**P<0.01,*P<0.05。

注：**P<0.01,*P<0.05圖3 桑根酮C對小鼠H22移植瘤生長的抑制作用與模型組比較Fig.3 inhibitory effect of sanggenon C on H22 tumor of mice

2.4 桑根酮C對荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

肝的臟器系數(shù)顯示(圖4)，桑根酮C高中低劑量組均小于陽性對照組，與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其腎臟指數(shù)與陽性對照組、空白組比較沒有顯著性差異；桑根酮C對心臟的作用(圖4)，高中低劑量組與空白組、陽性對照組比較沒有顯著性差異。

脾臟系數(shù)變化結(jié)果顯示(圖4)，高、中、低3個劑量的脾臟系數(shù)比空白組大，而比模型組小。低劑量組與空白組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。毒理學(xué)中,臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等，臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變[6-7]。通過以上分析可見，桑根酮C對小鼠脾臟、心臟、腎臟毒性比5-FU組小。

圖4 桑根酮C對荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.4 Effect of Sanggenon C on viscera index in mice with tumor

3 討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類健康和生命，已成為人類死亡的第一殺手。近幾十年，國內(nèi)外惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢。癌癥的治療手段主要是手術(shù)切除、放療、化療。雖然治療手段多，但化療藥物是必不可少的。對于較早期未擴散或轉(zhuǎn)移的癌灶，采用手術(shù)切除或放療較為成功，但對于晚期的腫瘤患者治療效果不大；而且放療、化療在殺死癌細胞的同時，也會殺死增殖旺盛的正常細胞，會導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、脫發(fā)和骨髓抑制等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了患者的生活。目前臨床采用的化療藥物帶來的不良反應(yīng)重、多，而且容易耐藥，導(dǎo)致預(yù)后效果差。由于常用的抗腫瘤藥物毒性大，選擇性差，在應(yīng)用中受到很大的限制，從而影響了藥物的療效。因此迫切需要尋找一種新的低毒的藥物和方法治療腫瘤。

桑根酮C是一類黃酮類化合物，存在于從?？浦参锷０灼ぶ衃6-8]。桑白皮為?？浦参锷５母稍锔?，具有抗癌、抗炎、降血壓、降血糖、和抗動脈粥樣硬化藥理作用，臨床可用于治療前列腺癌、高血壓，高血脂和高血糖等疾病[9-13]。桑白皮的甲醇提取物可通過抑制NF-ΚB的衰減從而誘導(dǎo)人宮頸癌細胞的凋亡，而且可以靶向殺滅腫瘤干細胞[14]，桑根酮C是桑根酮中含量高活性強的成分，可以作為候選抗癌藥物使用。

本研究通過觀察桑根酮C對腫瘤細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)該化合物能顯著抑制黑色素瘤和肝癌細胞的生長和增殖。同時通過考察桑根酮C 對移植瘤小鼠動物模型的影響，結(jié)果表明該化合物不僅能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，而且對小鼠的體重、生長幾乎沒有影響。桑根酮C作用于B16F10、B16F0細胞時，結(jié)果顯示使細胞外黑色素生成增加，而且較未加藥組有極顯著性差異，說明桑根酮C具有抑制黑色素瘤的作用。桑根酮C對小鼠的臟器指數(shù)的影響結(jié)果顯示，與模型組比較，對臟器指數(shù)的影響很小；與陽性對照組比較，臟器毒性也很小。由以上結(jié)果可知，桑根酮C具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤作用。本研究未涉及桑根酮C抗腫瘤作用的機制，需要通過進一步研究探討，闡明該化合物的作用機制和作用靶點，為該化合物的藥用開發(fā)提供依據(jù)。本研究還需進一步深入考察該化合物毒性反應(yīng)及體內(nèi)過程，為尋找新的高效低毒抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。