致犢牛腦炎大腸桿菌生物膜形成特性的研究

李蓓蓓，晁金平，蔣建軍，馬勛，王鵬雁

(石河子大學動物科技學院, 新疆 石河子 832000)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，通常被稱為大腸桿菌，屬于埃希氏菌屬，腸桿菌科，大多為溫血動物腸道中占優(yōu)勢的兼性厭氧寄居菌群[1]。根據大腸桿菌的致病機制，可將其分為共生型、腸道致病型、腸外致病型3種類型，其中，腸外致病性大腸桿菌可寄生在宿主腸道外的其它組織中，然后在幼畜和嬰兒中引起腦膜炎、腹瀉和敗血癥，具有高發(fā)病率、高死亡率的特點[2-3]。

犢牛患腦膜炎通常是由某些致病力較強的革蘭氏陰性菌感染產生，1周齡以內的初生犢牛常發(fā)生該病[4]。在未獲得足夠量初乳的情況下, 初生犢牛沒有足夠量的免疫球蛋白，不能抵擋致病微生物的侵襲，體內的某些微生物，通過血液、淋巴等途徑進入大腦感染致病，但也可能由臍部感染、口食引起[5]。

臨床表現(xiàn)上，一般呈典型的高熱，有嗜睡、癲癇、垂頭等癥狀，當犢?；贾囟葦⊙Y時，會出現(xiàn)虛脫和失血性休克等癥狀。病理變化主要表現(xiàn)為：腸系膜淋巴結發(fā)生腫大，肝、腎呈蒼白缺血狀態(tài)，包膜有出血點，患有腹瀉癥狀的病畜，胃腸黏膜會呈現(xiàn)出血性炎癥變化[6-9]。

細菌生物膜(Biofilms，BF)，是指附著于有生命或無生命物體表面被細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體，屬于一種細菌在險惡環(huán)境中的生長方式[10]。大腸桿菌生物膜的形成與其本身的結構有關，如黏附因子、毒力因子、細胞壞死因子和鐵載體[11]等，此外，它還與細菌生存環(huán)境有關，例如，培養(yǎng)環(huán)境中的溫度、pH、營養(yǎng)成分、鐵離子濃度和氧化還原電位變化等因素，都會影響生物膜的形成狀態(tài)及生長周期變化[11]。細菌對抗生素產生耐藥性主要是因為形成了生物膜[12-14]。在形成生物膜后，細菌可以通過多條途徑產生耐藥性，使抗生素根本不能進入其中發(fā)揮作用[15]。同時，細菌本身也會因為基因突變或者基因重組等變異現(xiàn)象，致使抗生素失去其真正的作用，給臨床疾病的防治帶來很大的困難[16]。

因此，本實驗以實驗室前期分離的致犢牛腦炎大腸桿菌為研究對象，通過設定不同pH、不同溫度以及不同時間觀察致犢牛腦炎性大腸桿菌生物膜特性，確定其生物膜形成的最適條件；在最佳條件下，與腸內共生型和禽腸外致病性大腸桿菌生物膜的形成進行比較。結果為后期研究其生物膜與耐藥性、毒力的相關性等提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

致犢牛腦炎大腸桿菌NJY9957及腸內共生型大腸桿菌，由石河子大學動物科技學院微生物實驗室鑒定保存，禽腸外致病性大腸桿菌由揚州大學老師惠贈。

1.2 主要儀器和試劑

超凈工作臺(上海博訊實業(yè)公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；倒置顯微鏡(上海光學儀器公司)；96孔培養(yǎng)板、LB培養(yǎng)基、結晶紫、乙醇丙酮等相關試劑(廣州東盛生物科技有限公司)。

1.3 菌株的復蘇

取-20 ℃凍干保存的菌株，吸取適量無菌水以溶解凍干菌塊，用接種環(huán)挑取菌液，于普通瓊脂平板上劃線，在37 ℃溫箱中培養(yǎng)16 h后，挑選單個菌落接種于LB肉湯中，37 ℃ 溫箱中搖菌培養(yǎng)12～16 h后備用。

1.4 生物膜定量檢測

1.4.1 生物膜的制備

在96孔培養(yǎng)板上每孔滴加LB液體培養(yǎng)基180 μL，滴加菌液20 μL，輕輕地做“十”字水平振晃，以混勻板孔中菌液和培養(yǎng)基。置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)一定時間后，用移液槍吸出培養(yǎng)基棄去，200 μL PBS緩沖液(高溫滅菌)緩緩沖洗板孔，反復洗3次以上，以除去孔中浮游的細菌，然后將培養(yǎng)板置于60 ℃烘箱中烘干?？瞻捉M加200 μL LB液體培養(yǎng)基作對照。

1.4.2 結晶紫染色

從烘箱中取出培養(yǎng)板，每孔滴加1%的結晶紫染液50 μL，室溫下染色，靜置15～20 min后，用移液槍吸出板孔中的結晶紫染液，流水輕輕沖洗掉多余的染液，倒置培養(yǎng)板于濾紙上將剩余水分除去，放置于烘箱中烘干。

1.4.3 生物膜形態(tài)結構觀察及OD值測定

徹底干燥后的培養(yǎng)板可以直接在倒置顯微鏡下觀察生物膜形態(tài)結構，通過調節(jié)顯微鏡選取較清晰且典型的視野采集圖像并記錄。

在培養(yǎng)板每孔滴加乙醇-丙酮200 μL進行脫色處理，靜置15～20 min后，在600 nm，37 ℃的條件下，用酶標儀測定每孔中溶液的OD值，對數(shù)據進行分析。

判定標準，基于臨界值ODc，可以分為4種不同生物膜類型菌株：OD>4×ODc為強黏附型，2×ODc

1.5 生物膜形成的影響因素

1.5.1 培養(yǎng)時間對生物膜形成的影響

對分離株進行生物膜制備，37 ℃條件下，培養(yǎng)8、12、24、36、48、72 h后，在倒置顯微鏡下觀察各時間段分離株生物膜形成狀態(tài)，采集圖像。并按照上述方法對各時間段分離株生物膜進行定量檢測，繪制折線圖，確定其形成周期。

1.5.2 溫度對生物膜形成的影響

將培養(yǎng)板分別放置于30、33、37、42 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，然后按照上述方法對不同溫度下培養(yǎng)的分離株生物膜形成狀況進行定量檢測。

1.5.3 pH值對生物膜形成的影響

配制LB液體培養(yǎng)基，pH值分別調節(jié)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，將分離株分別在各pH值培養(yǎng)基環(huán)境下進行生物膜的制備，37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，然后按照上述方法對不同pH值下培養(yǎng)的分離株生物膜形成狀況進行定量檢測。

1.6 3株大腸桿菌的生物膜形成比較

通過上述實驗，最終確定NJY9957株生物膜形成所需最佳條件后，分別將分離株、腸內共生型及禽腸外致病性大腸桿菌3株菌置于此條件下進行生物膜制備，并對3種菌株生物膜形成狀況進行定量檢測，作比較分析。

2 結果與分析

2.1 生物膜形態(tài)的顯微鏡觀察結果

大腸桿菌NJY9957株在37 ℃條件下分別培養(yǎng)8 、12、24、36、48、72 h后，倒置顯微鏡下觀察生物膜的形成，結果見圖1。

注：A～F，依次為大腸桿菌培養(yǎng)8、12、24、36、48、72 h后，生物被膜的生長狀態(tài)圖1 NJY9957在不同培養(yǎng)時間內形成生物膜的結構特點(×300)Fig.1 The characteristics of NJY9957 biofilm at different time (×300)

由圖1可知，8 h時有少量菌體開始黏附在載體表面，部分生物膜已開始生成，有趨勢向網狀繼續(xù)生長(圖1 A)；12 h時出現(xiàn)大量菌體黏附現(xiàn)象，生物膜結構較為連續(xù)，網格狀結構開始變得較為明顯(圖1B)；24 h時呈連續(xù)的致密的較為清晰的網格狀結構(圖1C)；36-72 h網格結構逐漸開始脫落，部分呈零星散落狀，生物膜的完整性也隨時間的延長逐漸下降(圖1D、圖1E、圖1F)。

結果表明，NJY9957株生物膜在8 h處于起始黏附階段，12～23 h大量菌體黏附，屬于集聚階段，24 h時形成完整的生物膜結構，屬于成熟穩(wěn)定期，24 h后生物膜完整性開始降低，出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，屬于播散期。

2.2 不同時間形成生物膜OD值測定結果

NJY9957株在37 ℃條件下分別培養(yǎng)8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h后進行定量檢測，結果見圖2。

圖2 NJY9957株分別在不同培養(yǎng)時間的OD值Fig.2 The influence of incubation time on NJY9957 biofilm formation

2.3 不同溫度形成生物膜OD值測定結果

NJY9957株分別在30 ℃、33 ℃、37 ℃、42 ℃溫度條件下培養(yǎng)24 h后進行定量檢測，結果見圖3。

圖3 NJY9957株分別在不同溫度下的OD值Fig. 3 The influence of incubation temperature on NJY9957 biofilm formation

由圖3可知，4種不同培養(yǎng)溫度檢測的OD600 nm值存在差異，溫度的不同對分離株生物膜形成具有一定的影響，在培養(yǎng)相同的時間后，確定最適合其生物膜形成的溫度為37 ℃。

2.4 不同pH值形成生物膜OD值測定結果

溫度37 ℃條件下，NJY9957株分別在pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的培養(yǎng)基環(huán)境培養(yǎng)，24 h后進行檢測OD600 nm值，結果見圖4。

圖4 NJY9957株分別在不同pH的OD值Fig.4 The influence of incubation pH on NJY9957 biofilm formation

由圖4可知，分離株生物膜的形成能力會受到培養(yǎng)環(huán)境pH值的影響，pH=4.0～7.0內，OD600 nm值隨pH增高逐漸升高，在pH=7.0時OD600 nm值最大，之后開始下降，由此確定最適合其生物膜形成的pH值為7.0。

2.5 3株大腸桿菌的生物膜形成比較結果分析

通過前3個試驗確定分離株形成生物膜所需最佳條件是溫度為37 ℃，培養(yǎng)基pH=7.0，培養(yǎng)時間為24 h，將分離株、共生型及禽腸外致病性大腸桿菌3種菌株在此條件下培養(yǎng)，基于臨界值ODc，以OD>4×ODc為強黏附型，2×ODc

表1 3株大腸桿菌生物膜粘附性分析結果Tab.1 Results of NJY9957, symbiotic type and poultry Extraintestinal Pathogenic E. coli biofilm adhesion

圖5 3株大腸桿菌的生物膜形成情況比較Fig.5 Comparing on the biofilm formation of NJY9957, symbiotic type and poultry Extraintestinal Pathogenic E. coli

3 討論與結論

本試驗對致犢牛腦炎大腸桿菌NJY9957株的研究發(fā)現(xiàn)，其生物膜在一定培養(yǎng)條件下能很快形成，8 h開始有菌體黏附，24 h形成成熟的生物膜，具有完整的網格狀結構，24 h后開始降解。這為確定大腸桿菌生物膜形成成熟結構的時間提供了相關依據，但不同菌株由于生物學特性等因素，其生物膜的形成能力不同，形成穩(wěn)定狀態(tài)所需培養(yǎng)時間也存在差異, 如致病性大腸桿菌O157:H7，其生物膜形成成熟的生物膜結構需要48 h[11]。生物膜的形成能力會受到環(huán)境中溫度、pH值等影響。研究發(fā)現(xiàn), 當培養(yǎng)環(huán)境的溫度降低時, 李斯特桿菌的生物膜形成能力會隨之降低[4]，而分枝桿菌生物膜在不同溫度環(huán)境下的形成能力表現(xiàn)不同；腸炎沙門氏菌生物膜形成的能力很容易受到pH值的影響，而糞腸球菌對pH值的耐受能力卻很強[18]。本研究對NJY9957生物膜在不同溫度和pH值條件下形成情況的研究發(fā)現(xiàn)，其生物膜的生成量，在一定范圍內隨溫度或pH值的升高而升高，分別在溫度為37 ℃、pH為7.0時達到最大值，之后開始降低。在所查閱文獻中，對大腸桿菌生物膜形成過程中受pH和溫度因素影響的試驗數(shù)據較少，本實驗過程中，pH和溫度的取值設定沒有明確的參考范圍，需要通過多組試驗進行選擇確定適合的取值。

有研究表明，生物膜形成的能力與細菌的耐藥性和毒力有關[12,14]。本試驗在對比3株大腸桿菌形成生物膜能力的結果中發(fā)現(xiàn)，共生型大腸桿菌形成生物膜的能力較其他兩株致病菌明顯要強。這也說明生物膜與毒力之間不存在直接正相關，但是與細菌的粘附力和數(shù)量具有直接關系。當然，本試驗只是對致犢牛腦炎大腸桿菌NJY9957株生物膜在不同條件下的形成情況做了相關的研究分析，為后期研究其生物膜與耐藥性、毒力的相關性等提供實驗依據。細菌生物膜形成的遺傳物質基礎、形成能力與毒力之間的關系以及耐藥機制等問題還需進一步的研究。

本研究確定了致犢牛腦炎大腸桿菌NJY9957株形成生物膜最適生長條件是溫度為37 ℃，培養(yǎng)基pH=7.0，培養(yǎng)時間為24 h，其生長周期：8 h有少量菌體開始黏附，處于起始黏附階段，12～23 h有大量菌體不斷地黏附，屬于集聚階段，24 h形成完整的生物膜結構，屬于成熟穩(wěn)定期，24 h后出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，生物膜開始降解，屬于散播期。在最佳條件下，與共生型和禽腸外致病性大腸桿菌比較結果為共生型大腸桿菌為強黏附型，NJY9957大腸桿菌為中等黏附型，禽腸外致病性大腸桿菌為弱黏附型。