多孔金屬支架組織學標本體內(nèi)體外的切片及染色方法

李靜 孫立國 呂榮 趙成相 吳拮（通訊作者）

（空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科研究所 陜西 西安 710032）

目前病理學對組織切片染色要求越來越高，不脫鈣骨、陶瓷材料、金屬組織用塑料包埋切片染色已經(jīng)應用廣泛。而金屬支架上培養(yǎng)細胞，目前在文獻上報道用電鏡掃描能觀察到細胞核，經(jīng)我室實驗研究得出，用Leica1600型鋸式切片機切片，其厚度為200～300μm，經(jīng)過磨片厚度為50μm用HE染色，結(jié)果支架間成骨細胞清晰。用靜態(tài)培養(yǎng)的細胞支架復合物植到動物體內(nèi)，組織經(jīng)切片磨片后，用Van Gieson（V-G）染色法染色，結(jié)果支架內(nèi)成骨和類骨質(zhì)明顯。

1.材料與方法

1.1 取材

支架材料由西南交通大學材料學院制備，制造基本原理是用快速成形對金屬直接制造技術(shù)以及電子束融化成型技術(shù)制備而成。一部分支架用于體外，將配制好的2ml細胞懸液，每隔5分鐘滴于支架組織上，滴完為止，用靜態(tài)培養(yǎng)1d、7d、14d，PBS液沖洗；另一部分把7d的細胞支架復合物植到動物（兔）體內(nèi)，4、8、12、16W分別取材，用10%福爾馬林固定后，流水沖洗半小時，梯度酒精脫水，二甲苯透明。

組織經(jīng)塑料I液、Ⅱ液、Ⅲ液分別浸潤5～7d。包埋液包埋。貼上標簽，將玻璃瓶放入抽真空泵內(nèi)抽5h以上，玻璃瓶加蓋，放入48℃水浴鍋內(nèi)聚合，完全凝固后，將玻璃瓶放入-20℃冰箱內(nèi)15min，拿出將玻璃瓶砸碎即可。

1.2 切片

用萊卡1600型切片機切片，切片200～250μm厚，再用砂紙將有機載玻片一面的邊緣打磨成2厘米毛邊，然后用1～2滴502膠水滴于載玻片另一面2/3處粘片，并輕壓切片，以免產(chǎn)生氣泡，待膠干透，方可麿片。

1.3 磨片

用千分尺測量磨片前厚度，用1500#砂紙放在骨組織試樣研麿機上麿片，邊磨邊加涼水，以免產(chǎn)生高溫損傷組織。然后在拋光機上加拋光膏拋光。顯微鏡觀察切片光亮且無劃痕，千分尺監(jiān)測量厚度，最終厚度為30～50μm。

1.4 染色

1.4.1 HE染色法 切片磨片拋光厚度為50μm，將切片放入蘇木精染液加熱至60℃ 2.5小時，水洗5分鐘，用1%鹽酸乙醇分化15秒，水洗2分鐘，稀氨水返藍1分鐘，水洗2分鐘，用80%乙醇脫水1分鐘，伊紅染色2分鐘，水洗2分鐘， 晾干即可。

1.4.2 Van Gieson（V-G）染色法 切片磨片拋光厚度為50μm，超聲洗片3分鐘，流水沖洗3分鐘，滴加0.1%甲酸3分鐘，流水沖洗3分鐘，滴加20%甲醇2分鐘，流水洗滌2分鐘，恒溫60℃下Stevenol藍染色3分鐘，60℃蒸餾水洗滌1分鐘，擦干，室溫下苦味酸—品紅染色15分鐘，水洗，晾干即可。

2.結(jié)果

多孔金屬支架組織經(jīng)塑料包埋，用Leica1600型鋸式切片機切片，其厚度為200～300μm，經(jīng)過磨片厚度為50μm，用HE染色，結(jié)果多孔金屬支架深黑色，細胞核藍色，胞漿紅色（圖1）。用Van Gieson（V-G）染色法染色，結(jié)果多孔金屬支架深黑色，膠原纖維綠或青，成骨橙或深紅，類骨質(zhì)黃綠，肌纖維藍或青（圖2）。

圖1 HE染色×50

圖2 V-G染色×50

3.結(jié)論

多孔金屬支架組織堅硬，需要通過不脫鈣硬組織包埋法，采用Leica 1600型鋸式切片機，雖可切出完整的切片，切片厚度200～300μm。但因切片太厚，顯微鏡下觀察，顏色不鮮亮，細胞核較模糊，無法觀察到骨細胞核和軟骨細胞核，只能采集到低倍的圖片，也不能很好區(qū)別不同的組織結(jié)構(gòu)。現(xiàn)如今組織形態(tài)學的研究對硬組織切片處理要求越來越精細，而現(xiàn)有的切片和染色方法難以滿足實驗需要。通常用的塑料包埋硬組織切片，雖可切出8μm厚完整切片，但由于鈦合金和人工骨材料堅硬，韌性差，一般烏鋼刀無法切出完整的切片。

目前在文獻上報道用電鏡掃描能觀察到細胞核，經(jīng)我室實驗研究得出，用Leica1600型鋸式切片機切片，其厚度為200～300μm，經(jīng)過磨片厚度為50μm，用HE染色，結(jié)果支架間成骨細胞清晰。用靜態(tài)培養(yǎng)的細胞支架復合物植到動物體內(nèi)，組織經(jīng)切片磨片后，經(jīng)Van Gieson（V-G）染色法染色，結(jié)果支架內(nèi)成骨和類骨質(zhì)明顯。同時對多孔金屬支架組織形態(tài)學計量參數(shù)的測量提供了可靠的依據(jù)。