溫度變化對南極假山毛櫸光合系統(tǒng)的影響

郝向春，周 帥，翟 瑜，韓麗君

（山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012）

環(huán)境溫度對植物的生理生化活動具有深刻影響，是決定植物生長發(fā)育和分布范圍的關(guān)鍵因素。適宜的溫度能使植物的光合效率最大化，加快有機物的合成與運輸，更高效地吸收水肥；低溫脅迫則會導(dǎo)致細(xì)胞器受損、細(xì)胞組織脫水、膜脂相變、活性氧（Reactiveoxygen species；ROS）大量產(chǎn)生、以及多糖等大分子物質(zhì)降解或變性[1]；高溫脅迫則對細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、蛋白質(zhì)、酶和RNA的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生負(fù)面影響[2]。研究表明，光合作用是對溫度變化最敏感的生理進(jìn)程之一[2]，高低溫脅迫能加速光合色素降解速率[1,3]，對光反應(yīng)和碳代謝均能造成較大傷害[2-5]。高低溫脅迫產(chǎn)生的大量ROS會造成光系統(tǒng)II（PhotosystemII；PSII）蛋白功能紊亂和脂質(zhì)過氧化[6]，這使得PSII成為光合系統(tǒng)中對脅迫最敏感的組分[2,7]。近年來，利用非損傷、檢測時間短、靈敏度高的葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)[8]，研究發(fā)現(xiàn)凍害脅迫（零下低溫）主要導(dǎo)致類囊體膜的光合反應(yīng)能力受損，主要作用部位位于放氧復(fù)合體（Oxygen-releasing complex；OEC）、PSII和光系統(tǒng)I（PhotosystemI；PSI）；冷害脅迫（零上低溫）主要降低PSII反應(yīng)速率，并抑制D1蛋白合成[5,7]；高溫則導(dǎo)致Rubisco酶、OEC、CF0-CF1 ATP酶的活性降低[9]?？焖俟忭憫?yīng)曲線（Rapid light curve；RLC）常被用來研究環(huán)境變化對光合作用光化學(xué)反應(yīng)的影響[10-11]，也可作為一種快速檢測手段對脅迫下植株的光合能力進(jìn)行評估[12]，已經(jīng)在植物非生物脅迫分析中廣泛使用[10]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)高低溫脅迫均能導(dǎo)致經(jīng)RLC推導(dǎo)出的多項參數(shù)顯著下降[13-14]。作為光合系統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)——葉綠素對高低溫脅迫較為敏感，多數(shù)植物的葉綠素合成最適溫度是20～30 ℃，低于2 ℃或高于40 ℃均會導(dǎo)致葉綠素的降解速率高于合成速率[3]。同時對高低溫脅迫下植株的葉綠素?zé)晒?、快速光響?yīng)曲線和葉綠素含量進(jìn)行觀測，既可以對脅迫下光合機構(gòu)的結(jié)構(gòu)性損傷進(jìn)行評估，也可以對脅迫導(dǎo)致的光反應(yīng)能量分配的功能性改變進(jìn)行分析，并能綜合評估光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的改變對葉片光合能力的影響。

南極假山毛櫸Nothofagus antarctica為殼斗科Fagaceae假山毛櫸屬Nothofagus落葉喬木或灌木，主要分布在南美洲南部的溫帶森林[15]。當(dāng)前國際上對林草復(fù)合系統(tǒng)中南極假山毛櫸的生存狀態(tài)、南極假山毛櫸的自交不親和與種間雜交現(xiàn)象，以及其在不同環(huán)境中表現(xiàn)的形態(tài)變化和采取的生存適應(yīng)策略等方面進(jìn)行了大量研究[16]，發(fā)現(xiàn)南極假山毛櫸具有環(huán)境適應(yīng)性強[17-19]、觀賞價值高[20]、經(jīng)濟(jì)價值大[21]、基因庫豐富[22-23]等優(yōu)勢，因此對其國際間引種也日益增多[15]。但現(xiàn)有研究尚缺乏對南極假山毛櫸溫度耐受性的研究，僅見對其能耐受的極端低溫的報道[24]，也沒有針對不同溫度下南極假山毛櫸光合系統(tǒng)變化的系統(tǒng)研究。本研究采用人工模擬高低溫脅迫的方法，觀測不同溫度處理下南極假山毛櫸葉片的葉綠素?zé)晒?、RLC和相對葉綠素含量（Relative chlorophyll content；SPAD）的變化，以期為南極假山毛櫸培育溫度的設(shè)置提供科學(xué)依據(jù)，完善南極假山毛櫸的引種馴化技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法

南極假山毛櫸實驗種子于2016年采自阿根廷內(nèi)烏肯?。?8°52′S，71°14′W，海拔1 240 m），試驗植株由山西省林業(yè)科學(xué)研究院繁育。選取長勢良好且一致的10株盆栽1年生苗，于2018年7月連盆土置于25℃的人工氣候箱（光照時間，6:00—18:00，12 h·d-1；光照強度，100 μmol·m-2s-1；相對濕度，60%±3%）中適應(yīng)培養(yǎng)3 d。利用人工氣候箱和裝有照明設(shè)備的冰柜模擬不同環(huán)境溫度，設(shè)置-5、5、15、25、30、35和40 ℃共7個溫度處理，每個溫度處理適應(yīng)24 h后開始各項測試，處理步驟如下。

降溫處理：選擇5株植株放入預(yù)先調(diào)至25 ℃的人工氣候箱，然后以5 ℃/h的速度依次降到各處理溫度，直至-5 ℃。-5 ℃處理在冰柜中完成。

升溫處理：選擇另外5株植株放入預(yù)先調(diào)至25 ℃的人工氣候箱，然后以5 ℃/h的速度依次升到各處理溫度，直至40 ℃。

每項測試在各處理環(huán)境中進(jìn)行，均選擇每株的同一片成熟葉片測試，每項測試每株測量1次，重復(fù)5次。測試按照快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)測定、穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)測定、快速光響應(yīng)曲線測定、葉綠素含量測定的步驟開展，以25 ℃的溫度處理為對照（CK）。

1.2 指標(biāo)調(diào)查與分析方法

1.2.1 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)的測定

將各溫度處理的葉片暗適應(yīng)20 min后，采用葉綠素?zé)晒鈨x（Yaxin-116G，雅欣理儀公司，中國），選取葉肉部分，用 3 000 μmol·m-2s-1飽和藍(lán)閃光照射1 s，以10 μs（300 μs之前）、100 μs（300 μs ～3 s之間）和1 ms（3 ms之后）的間隔記錄熒光信號，測得葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)。暗適應(yīng)后，PSII最大光化學(xué)效率Fv/Fm、單位面積反應(yīng)中心數(shù)量RC/CS、單位反應(yīng)中心復(fù)合體吸收的能量ABS/RC、單位反應(yīng)中心復(fù)合體中被核心捕獲的能量TRo/RC、單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量ETo/RC、捕獲的激子能導(dǎo)致電子傳遞的效率ψo(hù)、電子傳遞的量子產(chǎn)額ΦEo、葉片性能指數(shù)PIABS等參數(shù)計算見文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)的測定

將各溫度處理的葉片暗適應(yīng)20min后，采用前述葉綠素?zé)晒鈨x對各溫度處理的葉片進(jìn)行穩(wěn)態(tài)熒光測量，選取葉肉部分，按照飽和脈沖光（4 000 μmol·m-2s-1，持 續(xù)1 s）—遠(yuǎn) 紅 光（10 W·m-2，持續(xù)6 s）—黑暗（持續(xù)4 s）—光 化 光（1 500 μmol·m-2s-1，持 續(xù)9 s）的 順序，連續(xù)誘導(dǎo)7個周期，以10 μs（300 μs之前）、100 μs（300 μs ～3 ms之間）、1 ms（3 ms～300 ms之間）、100 ms（300 ms之后）的間隔記錄熒光信號，相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)由儀器自動給出。光化學(xué)猝滅系數(shù)qP、非光化學(xué)猝滅系數(shù)qN等參數(shù)計算見文獻(xiàn)[25]。PSII用于天線色素?zé)岷纳⒌哪芰勘壤鼶、用于光化學(xué)反應(yīng)的能量比例P、非光化學(xué)反應(yīng)耗散能量比例E等參數(shù)計算見文獻(xiàn)[26]。PSI熒光強度F1計算見文獻(xiàn)[27]，總熒光強度中PSI熒光強度的占比C=F1/F0，F(xiàn)0表示暗處理后的最小熒光產(chǎn)量。

1.2.3 快速光響應(yīng)曲線的測定

使用便攜式調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x（PAM-2500，Walz，德國）對光適應(yīng)1 h的各溫度處理葉片的葉肉部分進(jìn)行光響應(yīng)曲線測量，光強梯度設(shè)定為0、20、50、100、300、600、900、1 200、1 500、1 800、2 000 μmol·m-2s-1，每個梯度光照持續(xù)時間20 s，之后利用儀器配套軟件PamWin_3的曲線擬合功能[28]獲得相關(guān)參數(shù)。α、ETRmax、IK分別表示光能利用效率、最大電子傳遞速率和半飽和光強。

1.2.4 葉綠素含量的測定

采用葉綠素測定儀（SPAD-502Plus，KONICA MINOLTA，日本）測定各溫度處理葉片的葉肉部分的SPAD。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel 2010和SPSS 22.0，非線性回歸擬合和繪圖采用Origin2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線的影響

經(jīng)過暗適應(yīng)后轉(zhuǎn)入飽和脈沖光強照射，南極假山毛櫸葉片的葉綠素?zé)晒庋杆偕仙?jīng)過O、J、I、P各點后逐漸平穩(wěn)，其中-5 ℃處理的熒光強度最高，15 ℃和30 ℃處理的熒光強度明顯偏低（圖1-Ⅰ）。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，可見各條曲線在J點有明顯分散，低溫脅迫（-5、5和15 ℃等處理，下同）的熒光強度高于高溫脅迫（30、35和40 ℃等處理，下同），CK的熒光強度最低（圖1-Ⅱ）。將標(biāo)準(zhǔn)化的各處理曲線與CK相減，可見高溫脅迫下，J、I點的熒光強度隨著溫度升高逐漸增加；低溫脅迫誘導(dǎo)J、I點的熒光強度由大到小依次是-5、15、5 ℃（圖1-Ⅲ）。高溫脅迫下，K點的熒光強度隨溫度上升而逐漸明顯；低溫脅迫下，只有-5 ℃和5 ℃的K點較明顯（圖1-Ⅳ）。高低溫脅迫下均能觀察到L點出現(xiàn)，并且隨著低溫脅迫的加劇，L點愈加明顯（圖1-Ⅴ）。

2.2 溫度對葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)的影響

溫度變化導(dǎo)致多項南極假山毛櫸葉片的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)在25 ℃處理時達(dá)到最大值，-5 ℃或40 ℃處理時降低到最小值。

高低溫脅迫對PSⅡ反應(yīng)中心復(fù)合體能量的吸收和傳遞均構(gòu)成負(fù)面影響。高溫脅迫下，PSII單位反應(yīng)中心復(fù)合體吸收的能量ABS/RC和單位反應(yīng)中心復(fù)合體中被核心捕獲的能量TRo/RC以及單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量ETo/RC均呈現(xiàn)下降趨勢，40 ℃脅迫時分別比CK下降了8.6%、9.1%（P＜ 0.05）和17.1%（P＜ 0.05）。低溫脅迫導(dǎo)致ETo/RC持續(xù)顯著下降，-5 ℃脅迫時僅為CK的80.6%（P＜ 0.01）。低溫脅迫對量子產(chǎn)額或流量比的抑制比高溫脅迫明顯，-5 ℃脅迫時，電子傳遞的量子產(chǎn)額ΦEo和捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA-下游的其他電子受體的概率ψo(hù)分別比CK下降了18.9%（P＜ 0.01）和16.9%（P＜ 0.01），而40 ℃脅迫時兩者僅比CK下降了9.4%和7.7%（表1）。

高低溫脅迫使PSII單位面積反應(yīng)中心數(shù)量RC/CS增加，-5 ℃和40 ℃脅迫時分別比CK增加了12.8%和6.9%。性能參數(shù)PIABS對某些脅迫比PSII最大量子產(chǎn)率Fv/Fm能更好地反映脅迫對光合機構(gòu)的影響[4]，-5 ℃和40 ℃脅迫時PIABS分別比CK下降了37.9%（P＜ 0.05）和18.0%，而Fv/Fm都只下降了1.3%（表1）。

2.3 溫度對穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖1 不同溫度處理對葉片葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線的影響Fig.1 Effects of different temperature treatments on the chlorophyll fluorescence kinetics curve of leaves

表1 不同溫度處理下的葉綠素?zé)晒鈪?shù)?Table 1 Chlorophyll (Chl) a fluorescence variables in different temperature treatments

高低溫脅迫對光化學(xué)猝滅系數(shù)qP無顯著影響，顯著抑制非光化學(xué)猝滅系數(shù)qN；-5 ℃和40 ℃脅迫時，qN與CK相比分別極顯著下降了30.4%（P＜ 0.01）和82.1%（P＜ 0.01）。高低溫脅迫下，PSII用于天線色素?zé)岷纳⒌哪芰勘壤鼶與CK相比無顯著差異，但PSII非光化學(xué)反應(yīng)耗散能量比例E顯著上升，40 ℃和-5 ℃脅迫時分別比CK上升了110.0%（P＜ 0.01）和43.3%（P＜ 0.01）。高溫脅迫比低溫脅迫對PSII用于光化學(xué)反應(yīng)的能量比例P的負(fù)面影響顯著，40 ℃和-5 ℃時分別比CK下降了81.1%（P＜ 0.01）和24.3%（P＜ 0.05）。與CK相比，高溫脅迫誘導(dǎo)PSI熒光強度F1和總熒光強度中PSI熒光強度的占比C/F0極顯著上升，40 ℃時分別是CK的178.1%（P＜ 0.01）和182.4%（P＜ 0.01），低溫脅迫對兩項參數(shù)的影響不顯著（表1）。

2.4 溫度對光響應(yīng)曲線的影響

各低溫脅迫處理的RLC均低于CK，并且差異不明顯；高溫脅迫處理的RLC從高到低依次是35、30、40 ℃（圖2），反映植物的光能利用能力參數(shù)α在35 ℃時達(dá)到最大值（0.26），在45 ℃時達(dá)到最小值（0.16)。ETRmax表示無光抑制時的最大電子傳遞速率，伴隨溫度的升高，在35 ℃時極顯著升高到CK的245.3%（P＜ 0.05），但40 ℃時又回降到CK的53.9%；隨著溫度的降低，ETRmax也持續(xù)下降，但與CK無顯著差異。Ik反映植物對強光照的耐受性，隨著溫度的上升，35 ℃時Ik極顯著上升到CK的144.9%（P＜ 0.01），40 ℃時又快速回落到CK的70.8%（P＜ 0.05）；低溫脅迫導(dǎo)致Ik持續(xù)降低，但與CK無顯著差異（表1）。

圖2 不同溫度處理對葉片光響應(yīng)曲線的影響Fig.2 Effects of different temperatures on the RLC of leaves

2.5 溫度對葉綠素含量的影響

溫度脅迫下SPAD的變化可以反映光化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)物質(zhì)的變動情況。高溫導(dǎo)致SPAD顯著下降，30 ℃和35 ℃脅迫時分別比CK降低了15.6%（P＜ 0.05）和18.1%（P＜ 0.05），40 ℃脅迫時略有上升，但仍然比CK低13.7%；低溫脅迫對SPAD無顯著影響，15、5、-5 ℃脅迫時分別比CK降低了1.0%、1.6%、3.8%（表1）。

2.6 南極假山毛櫸光合作用的最適溫度預(yù)測

由表1可知，ETo /RC在多個溫度處理下均與CK形成顯著差異，說明溫度變化極易通過干擾PSⅡ單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量，導(dǎo)致南極假山毛櫸的光合速率發(fā)生改變。對不同溫度處理所得的ETo/RC進(jìn)行非線性擬合，得到5個潛在擬合函數(shù)（表2），其中Edgeworth-Cramer函數(shù)具有最高的AIC、adjR和SEE，所以確定為最優(yōu)擬合函數(shù)，函數(shù)的極大值為23.83℃（圖3）。

表2 潛在擬合函數(shù)與相應(yīng)的AIC，BIC，adjR和SSETable 2 The latent function and the corresponding AIC,BIC,adjR and SSE

圖3 不同溫度處理下ETo/RC的非線性擬合Fig.3 Non-linear fitting of ETo/RC under different temperatures

3 討論與結(jié)論

通過快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線和JIP-的測定，可以發(fā)現(xiàn)高低溫脅迫主要引起南極假山毛櫸葉片PSII反應(yīng)復(fù)合體的電子傳遞受阻以及PSII放氧復(fù)合體受損，其主要表現(xiàn)是脅迫下ETo/RC持續(xù)顯著下降，這表明光合作用Z鏈中脫鎂葉綠素（Pheo）傳遞電子至醌（QA、QB）的路徑不暢，以及葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線中出現(xiàn)K點和L點，這預(yù)示了放氧復(fù)合體受損[29-30]和PSII各單位之間的能量流通不暢[31]。這一現(xiàn)象與已有研究結(jié)果相符[9]，其機理可能源于PSII捕光復(fù)合體內(nèi)的植物光合色素的光吸收能力較穩(wěn)定，短期環(huán)境脅迫較難改變其性能[32]，但環(huán)境脅迫會降低光合速率，這必然導(dǎo)致葉片吸收的光能不能及時被固定而出現(xiàn)光能過剩[4]。在本研究中，低溫脅迫對SPAD無顯著影響，高溫脅迫雖然誘導(dǎo)SPAD顯著下降，但降幅最高僅為CK的18.1%；同時，高低溫脅迫下，反應(yīng)光合效率的α、ETRmax和IK等參數(shù)均不同程度下降，而qN則持續(xù)上升，表明南極假山毛櫸出現(xiàn)了光能過?，F(xiàn)象。

研究顯示，脅迫下植物葉片通過增加熒光散射量以減輕光能過剩引起的光傷害[33]。為應(yīng)對高低溫脅迫導(dǎo)致的光能過剩，南極假山毛櫸也采取了類似策略，即增加葉片的熒光散射強度，以耗散掉多余的吸收光能。例如快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線的J和I點熒光強度上升，40 ℃和-5 ℃脅迫時E分別比CK顯著上升了110.0%（P＜ 0.01）和43.3%（P＜ 0.01），以及高溫脅迫下F1和C/F0極顯著上升。在高低溫脅迫下，南極假山毛櫸PSII的RC/CS在-5℃和40℃脅迫時分別比CK增加了12.8%和6.9%，在以往類似的溫度脅迫研究中，也觀察到RC/CS有上升[34]和下降2種變化趨勢[35-36]，推測這是南極假山毛櫸抵御脅迫的另一種方式，即通過增加PSII單位面積光合機構(gòu)含有的反應(yīng)中心數(shù)量，以加大光能吸收量。但因為已有的反應(yīng)中心數(shù)量有限，合成新的反應(yīng)中心需要時間與原料，導(dǎo)致第一種策略的效果不理想，所以脅迫下RC/CS與CK相比沒有達(dá)到顯著差異。已有研究發(fā)現(xiàn)，為維持光合能量傳遞的穩(wěn)定性，PSII和PSI之間可以通過能量溢出機制，將PSII多余的能量傳遞到PSI，幫助其進(jìn)行能量耗散[33]。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著高溫脅迫程度的加深，PSI的熒光散射強度也隨之增強，這可能是減緩PSII光傷害的第3項措施。

低溫脅迫對南極假山毛櫸RLC的α、ETRmax和IK沒有顯著影響，說明其實際和潛在光合能力對低溫有較好的耐受性，與文獻(xiàn)報道南極假山毛櫸耐寒性強的結(jié)論相符[24]。本研究得出南極假山毛櫸光合作用的最適溫度是23.83 ℃，這一溫度低于通常C3植物的最適溫度（25 ℃左右）[3]，預(yù)示南極假山毛櫸耐寒性強的重要生理基礎(chǔ)可能是其光合系統(tǒng)能在較低溫度下運行。關(guān)于南極假山毛櫸能耐受的最高環(huán)境溫度還未見報道，但有研究發(fā)現(xiàn)，接近30 ℃的環(huán)境溫度對南極假山毛櫸的生長沒有顯著影響[19]，本研究也發(fā)現(xiàn)高溫35 ℃脅迫時才導(dǎo)致多項參數(shù)顯著下降。研究中還發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫對南極假山毛櫸光合系統(tǒng)的損傷明顯大于低溫脅迫，在高溫40 ℃脅迫下，多項參數(shù)數(shù)值低于-5 ℃的數(shù)值，其機理還需進(jìn)一步探究。