產(chǎn)3—羥基丁酮菌株的分離·篩選與鑒定

羅琴 聶波 宋志遠

摘要 從土壤中分離獲得一株高產(chǎn)3-羥基丁酮的菌株ME-N11。該菌株3-羥基丁酮轉(zhuǎn)化率高，僅產(chǎn)生少量的2，3-丁二醇、乙醇、乙酸等副產(chǎn)物，具有重要開發(fā)應(yīng)用價值。在對其形態(tài)特征及生理生化特性分析的基礎(chǔ)上，采用PCR擴增了其16S rRNA基因，并進行了測序?；谠摼纳砩匦耘c16S rRNA基因的同源性進行比較及系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)該菌株和Bacillus subtilis同源性達99%，命名為Bacillus subtilis ME-N11。

關(guān)鍵詞 3-羥基丁酮；16S rRNA；系統(tǒng)發(fā)育；枯草芽孢桿菌

中圖分類號 TS202.3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.001

Abstract An acetoin producing strain MEN11 was isolated from soil.The strain had a high acetoin conversion rate，and only produced a small amount of the corresponding byproducts，such as 2，3butanediol，ethanol and acetic acid.It showed a potential widely application in industry.16S rRNA gene sequence of the strain was then amplified by PCR，and its nucleotide was sequenced.Based on the analysis of its physiological and biochemical properties，homology and phylogenetic of 16S rRNA gene sequence，the strain showed 99% similarity with Bacillus subtilis，and was designated as Bacillus subtilis MEN11.

Key words Acetoin；16S rRNA；Phylogeny；Bacillus subtilis

3-羥基丁酮（3-Hydroxy-2-butanone）又名乙偶姻（acetoin）、甲基乙酰甲醇（acetylmethylcarbinol），天然存在于乳品和某些水果中，是一種應(yīng)用廣泛的食用香料，具有令人愉快的奶油香味，我國GB2760—86規(guī)定其允許食用，美國食品和萃取協(xié)會（FEMA）安全號為2008[1]。3-羥基丁酮作為香料應(yīng)用范圍極其廣泛[2—3]，用量也很大。此外，3-羥基丁酮還可作為一種平臺化合物，廣泛應(yīng)用于日化食品、制藥、涂料、液晶材料等領(lǐng)域。2004年，美國能源部將其列為30種優(yōu)先開發(fā)利用的平臺化合物之一[4]，近年來，隨著人們對3-羥基丁酮需求的不斷增長，有關(guān)3-羥基丁酮的生產(chǎn)方法及應(yīng)用研究已引起人們的廣泛關(guān)注。

目前3-羥基丁酮的合成方法主要有2種：一是化學合成法，二是生物合成法?；瘜W合成法存在產(chǎn)品收率低、環(huán)境污染較嚴重等缺點，而且其產(chǎn)品質(zhì)量很難達到目前3-羥基丁酮的最大消費領(lǐng)域——食用香料的要求，更為嚴重的是化學合成法的原料大都是利用不可再生的化石資源，其原料來源受到限制[2]。相比而言，生物合成法可以摒棄化學合成法的這些缺陷，有望成為3-羥基丁酮合成的主要方法，據(jù)報道能夠代謝產(chǎn)生3-羥基丁酮的菌株主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、克雷伯氏菌屬（Klebisella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、沙雷氏菌屬（Serratia）以及乳球菌屬（Lactococcus）等[2]。然而，在大多數(shù)菌株代謝過程中，3-羥基丁酮的積累量均較低，大都作為2，3-丁二醇的代謝副產(chǎn)物而產(chǎn)生。目前3-羥基丁酮高產(chǎn)菌株主要是芽孢桿菌屬中的短小芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌[5-7]?？紤]到從自然界直接分離高產(chǎn)菌株是3-羥基丁酮育種工作中最經(jīng)濟實用的方法，筆者采用自然選育，篩選獲得了一株高產(chǎn)3-羥基丁酮的菌株，并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 產(chǎn)3-羥基丁酮菌株的篩選

1.1.1 主要培養(yǎng)基。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10000 g/L，酵母膏5000 g/L，NaCl 5000 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10000 g/L，酵母膏5000 g/L，NaCl 5000 g/L，瓊脂20000 g/L。

Voges-Proskauer（V-P）培養(yǎng)基：蛋白胨 5000 g/L，葡萄糖 5000 g/L，K2HPO4 5000 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 100000 g/L，K2HPO4·3H2O 6.600 g/L，KH2PO4 2.000 g/L，（NH4）2HPO4 3.300 g/L，（NH4）2SO4 6.600 g/L，MgSO4·7H2O 0.250 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.050 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 g/L，MnSO4·4H2O 0.001 g/L。

以上培養(yǎng)基如有需要加入0.2%～0.6%丙烯醇，pH均調(diào)至7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min。

1.1.2 土樣采集。

從江蘇南京珍珠泉風景區(qū)、蘋果園、草莓園等不同地點5～10 cm土層采集土樣5份，采集好的土樣立即帶回實驗室進行處理。

1.1.3 菌株分離。在菌株代謝過程中，3-羥基丁酮作為2，3-丁二醇的副產(chǎn)物而少量存在，通常積累濃度較低[8]。因此，從自然界中篩選出伴隨還原態(tài)副產(chǎn)物2，3-丁二醇產(chǎn)量低的3-羥基丁酮高產(chǎn)菌株是實現(xiàn)3-羥基丁酮高效積累的有效途徑。由于產(chǎn)芽孢的芽孢桿菌屬是一類能夠積累3-羥基丁酮的菌種，試驗設(shè)計了從土樣中通過加熱富集篩選出產(chǎn)芽孢的細菌，再通過V-P （Vagex-Proskauer） 試驗鑒定[9]，篩選出V-P陽性菌株（能夠積累3-羥基丁酮），然后通過含丙烯醇的分離培養(yǎng)基分離出2，3-丁二醇脫氫酶活力較低的菌株（2，3-丁二醇脫氫酶催化微生物體內(nèi)3-羥基丁酮和2，3-丁二醇之間的可逆反應(yīng)；丙烯醇能夠被醇脫氫酶還原為丙烯醛[10]，而丙烯醛對微生物細胞具有強烈的毒害作用，因此，醇脫氫酶活性高的菌株不能夠在含有丙烯醇的分離培養(yǎng)基中存活，醇脫氫酶活性不高的菌株（能顯著積累3-羥基丁酮）則能夠在其中存活下來），最后通過發(fā)酵驗證檢測，最終篩選出伴隨還原態(tài)副產(chǎn)物2，3-丁二醇產(chǎn)量極低的3-羥基丁酮高產(chǎn)菌株。

1.1.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。

將上述挑選出的菌株轉(zhuǎn)接至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h，對發(fā)酵液中3-羥基丁酮含量進行檢測，先在520 nm下測定其吸光度，應(yīng)用上述公式計算出3-羥基丁酮的量。3-羥基丁酮的產(chǎn)量高的菌株進一步利用液相色譜法檢測驗證[17]，挑選出產(chǎn)量高的菌株進一步試驗。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 生物量的測定。

利用UV1200型紫外分光光度計在波長600 nm處測定其吸光度（A600）。

1.2.2 葡萄糖濃度測定。

利用生物傳感儀SBA-40C（山東省科學院生物研究所）測定葡萄糖濃度。

1.2.3 3-羥基丁酮定性測定。

3-羥基丁酮在堿性條件下氧化生成丁二酮，丁二酮與胍基化合物反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，α-萘酚可促進該紅色化合物的生成，可用于3-羥基丁酮的定性檢測。 該紅色化合物在波長520 nm處有最大吸收，顏色的深淺與溶液中丁二酮和3-羥基丁酮的濃度呈線性關(guān)系，可用于測定3-羥基丁酮的含量[11]。

1.2.4 3-羥基丁酮定量測定。

3-羥基丁酮濃度檢測[12]：利用DIONEX P680液相色譜儀檢測。色譜分離柱：BioRad公司Aminex HPX-87H離子色譜柱（300 mm×7.8 mm，）；檢測器：SHODEX RI-101折光示差檢測器；流動相：5 mmol/L H2SO4水溶液；流動相流速：0.5 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：65 ℃。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株生理生化特征及形態(tài)學觀察。

①在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

②參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》《微生物學實驗手冊》《Bergey細菌鑒定手冊》和《芽孢桿菌生物學及其應(yīng)用》上的鑒定方法[13-15]。

1.3.2 細胞全基因組的提取。按照細菌基因組提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0）的操作步驟提取細菌的全基因組。

1.3.3 16S rRNA基因的擴增。

采用細菌16S rRNA基因通用引物進行擴增，引物序列：

正向引物BSF（8/20）5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物BSR（1541/20）5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

1.3.4 PCR擴增條件。

PCR反應(yīng)體系：DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，ddH2O 15.3 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 1.5 μL，dNTP-mix 2.0 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，Taq酶0.3 μL，總反應(yīng)體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 4 min；30個循環(huán)；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s；最后72 ℃保溫10 min，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存。

1.3.5 PCR產(chǎn)物的克隆與16S rRNA基因序列測定。

采用TaKaRa膠回收試劑盒（Takara Argarose Gel DNA purification Kit version 2.0）純化PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳驗證。純化后的PCR產(chǎn)物連接到測序載體pMD 18-T Simple，轉(zhuǎn)化E.coli TG1。提取質(zhì)粒，經(jīng)過藍白斑篩選后挑選出陽性克隆菌株培養(yǎng)用于測序?；驕y序由南京金斯特生物科技有限公司完成。

1.3.6 同源性比較、系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

將已測出的部分16S rRNA （1 540 bp）基因序列運用NCBI的BLAST程序比對數(shù)據(jù)庫中芽孢桿菌屬的16S rRNA基因，分別選擇不同種中相似性高的菌株用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，系統(tǒng)發(fā)育樹用Mega 4.0軟件構(gòu)建完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

設(shè)計了一種培養(yǎng)基加有不同濃度丙烯醇，從各地土壤樣品中初篩分離得到300株菌，并通過3-羥基丁酮定性檢測，得到120株產(chǎn)3-羥基丁酮的菌株。分別測定篩選獲得菌株的生物量和發(fā)酵液中3-羥基丁酮含量，大部分集中于中等水平，高水平的較少，結(jié)果見表1，其中ME-N11菌株3-羥基丁酮含量相對較高。該菌株生長速度快，3-羥基丁酮產(chǎn)量較穩(wěn)定，為進一步育種與構(gòu)建高產(chǎn)基因工程菌株奠定良好基礎(chǔ)。

2.2 菌株形態(tài)學特征

菌株ME-N11為桿狀，寬0.7～0.8 μm，長2～3 μm，有側(cè)生鞭毛，革蘭氏染色陽性。該菌在平板中培養(yǎng)前期菌落表面光滑濕潤，在培養(yǎng)后期菌落邊緣起皺（圖1）。

2.3 菌株生理生化特征

菌株ME-N11為好氧菌，能在2%～7% NaCl濃度下生長，在10% NaCl濃度下不能生長。生長的最低溫度為10 ℃，最適溫度為35 ℃，最高生長溫度為50 ℃。具有淀粉酶、過氧化氫酶活性，不具有卵黃卵磷脂酶活性。能夠利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、檸檬酸鹽。能夠水解明膠、酪蛋白、淀粉和還原硝酸鹽。不產(chǎn)生吲哚，將其與芽孢桿菌屬中典型種Bacillus subtillus的生理生化特征進行比較，結(jié)果見表2。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

PCR獲得了ME-N11菌株 16S rRNA基因的部分片段，長度為1 540 bp（圖2），經(jīng)純化和測序獲得了該片段的序列，利用BLAST程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行比對，基于相關(guān)同源性高的菌株16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明，其序列與ApetroaieConstantin等[16]報道的Bacillus subtilius 16S rRNA基因序列相似性最高（NCBI數(shù)據(jù)庫資料），達99%。ME-N11菌株的16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登入號為GQ303255。

3 結(jié)論與討論

該研究從土壤中篩選獲得120株產(chǎn)3-羥基丁酮菌株，進一步篩選挑選出產(chǎn)量較高菌株ME-N11，該菌株通過16S rRNA基因序列分析法鑒定發(fā)現(xiàn)與枯草芽孢桿菌的16S rRNA基因序列同源性達99%，與常規(guī)生理生化特征試驗結(jié)果相吻合。利用糖質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)3-羥基丁酮菌株已有大量報道，其中3-羥基丁酮大多作為2，3-丁二醇的代謝副產(chǎn)物。

然而以3-羥基丁酮為主要產(chǎn)物的菌株鮮有報道。目前對該菌株結(jié)構(gòu)特點、理化特性還在進一步研究中。通過對該菌發(fā)酵條件的優(yōu)化以及菌種改良等措施，進一步提高3-羥基丁酮的產(chǎn)量是今后研究的主要方向。

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