海南省柑橘主產區(qū)黃龍病和病毒病的發(fā)生危害情況調研初報

崔一平 彭埃天 李子力 凌金峰 宋曉兵 郭澤成 陳霞 程保平 殷瑜

摘要 柑橘是我國南方重要的水果之一，柑橘黃龍病和柑橘病毒病已經對我國柑橘的安全生產造成了嚴重威脅。為了解柑橘黃龍病和病毒病對海南柑橘產業(yè)的危害情況，本研究通過熒光定量PCR（Quantitative PCR）和反轉錄PCR（RT-PCR）分別對隨機采集自海南柑橘主產區(qū)澄邁縣3個福橙種植園和瓊中縣4個綠橙種植園共計109個樣品進行了柑橘黃龍病和柑橘5種主要病毒病的檢測。結果表明：澄邁縣福橙標準化種植示范基地和瓊中縣營根鎮(zhèn)綠橙種植園2個新植橘園的柑橘黃龍病發(fā)病較輕，檢出率僅為8%和11%，而其他5個橘園的柑橘黃龍病檢出率均在75%以上，嚴重的達100%。除此之外，7個橘園均未檢測到柑橘褪綠矮縮病毒;澄邁縣和瓊中縣的衰退病毒病檢出率分別在52.9%和77.8%以上，黃脈病毒病在83.3%和90%以上。澄邁縣還檢測到碎葉病毒病的存在，檢出率在38.1%以上，除紅湖農場外還存在裂皮病毒病，檢出率在11.8%以上。瓊中縣的綠橙種植園3還存在裂皮病毒病，檢出率為43.8%。綜上所述，柑橘黃龍病和病毒病已經嚴重威脅到海南省福橙和綠橙主產區(qū)的柑橘生產安全。加強對海南柑橘苗木安全生產的同時，亟需采取有效的田間綜合防控措施，以促進海南柑橘產業(yè)的健康發(fā)展。

關鍵詞 柑橘黃龍病; 柑橘病毒病; 海南省; 柑橘

中圖分類號： S 412

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018359

柑橘是我國南方一種重要水果，柑橘黃龍病（citrus Huanglongbing）是目前世界柑橘生產上最具有毀滅性的病害之一[1]。該病害已廣泛分布于中國、印度、南非、美國和巴西等世界上50多個柑橘種植國家。我國的柑橘黃龍病主要分布在廣東、廣西、福建、海南、江西等主要柑橘種植區(qū)域，此外湖南、浙江、四川、云南、貴州和臺灣等省市柑橘種植區(qū)域也有發(fā)生。引起我國柑橘黃龍病的病原為α變形菌綱韌皮部桿菌屬亞洲種Candidatus Liberibacter asiaticus，（Las）[24]。該種為耐熱型（28～32℃），傳播媒介為柑橘木虱Diaphorina citri[5]。黃龍病菌主要通過柑橘木虱、帶病苗木、嫁接等進行傳播，但不能通過汁液摩擦及土壤傳播;同時在柑橘樹體內的繁殖擴展受到柑橘維管束的限制。目前引起柑橘黃龍病的病原菌還不能人工培養(yǎng)，同時也沒有發(fā)現防治柑橘黃龍病的有效藥劑。

柑橘黃龍病可在柑橘上形成典型癥狀：如葉片褪綠均勻黃化或斑駁、革質化，葉脈粗大，果實出現“紅鼻子果”等。田間柑橘黃龍病發(fā)病癥狀有時極易與柑橘田間缺素癥、病毒病及藥肥害等癥狀相混淆，肉眼進行鑒別診斷，準確率不高，易誤判。因此，利用現代科技手段，采用合適的方法對柑橘黃龍病進行準確的診斷就顯得尤為重要。目前較多采用PCR（polymerase chain reaction）對柑橘黃龍病進行分子診斷[68]（http：∥www.rec.ri.cmu.edu/usda）。常見的PCR檢測法有常規(guī)PCR、巢式PCR和實時熒光PCR。2014年，程保平等通過試驗比較了以上3種方法檢測柑橘黃龍病的靈敏度，發(fā)現熒光定量PCR方法明顯優(yōu)于其他2種方法，且具有操作簡便、檢測靈敏度高、結果數字化可讀性強及可以量化等優(yōu)點，是目前公認的較為準確的一種柑橘黃龍病檢測方法[9]。

在田間，柑橘病毒病能夠在柑橘上造成與柑橘黃龍病相類似的癥狀。柑橘病毒病的發(fā)生嚴重影響柑橘植株的生長和柑橘的品質，同時威脅柑橘的苗木安全。本文選取我國已報道過的5種病毒病（柑橘衰退病毒病、柑橘裂皮病毒病、柑橘碎葉病毒病、柑橘褪綠矮縮病毒病及柑橘黃脈病毒病）的引物，采用RT-PCR方法對來自海南的樣品進行檢測。其中，柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus （CTV）、柑橘裂皮病類病毒Citrus exocortis viroid（CEVd）、柑橘碎葉病毒Citrus tatter leaf virus（CTLV）是3種嚴重威脅柑橘生產的病毒，在世界范圍內廣泛分布[12];柑橘褪綠矮縮病毒Citrus chlorotic dwarf associated virus（CCDaV）為2012年Loconsole等在柑橘上鑒定出來的一種單鏈DNA類病毒，該病毒主要危害檸檬、葡萄柚、橘橙等柑橘品種，在我國少數地區(qū)存在[13];柑橘黃脈病毒Citrus yellow vein clearing virus（CYVCV）為陳洪明等于2015年在‘尤力克檸檬上新發(fā)現的病毒，所引起的病害為嫁接傳染性病害[14]。

海南省‘綠橙和‘福橙是20世紀80年代從廣東廉江引進的‘紅江橙Citrus tangerine Hort. Et Tanaka×Citrus sinensis （L.） Osbeck經過多年培育而來。瓊中縣和澄邁縣分別是海南柑橘‘綠橙、‘福橙的主產區(qū)?！傊芯G橙是海南省的名牌產品，獲國家農業(yè)部無公害農產品認證和國家綠色食品認證。2006年1月，“瓊中綠橙”商標被國家商標局批準注冊，是海南省第1個有地理標志證明的商標[10]。澄邁‘福橙在2008年被定為國宴果品，同年申請注冊了“澄邁福橙”商標。調查表明，由于柑橘黃龍病的危害，瓊中縣‘綠橙的種植面積從1998年以來到2015年呈現拋物線式發(fā)展（圖1）。自2006年首次在海南省發(fā)現柑橘黃龍病以來，瓊中縣幾乎所有的柑橘產地都有發(fā)生[16]。2008年瓊中縣‘綠橙的種植面積達到最高點，約2 800 hm2。此后，2008年-2013年期間，柑橘種植面積銳減;至2015年-2016年，柑橘種植面積銳減為800 hm2，幾乎恢復到了2002年前的水平[17]。近年來，柑橘黃龍病對海南省柑橘產業(yè)危害的報道不斷出現，特別是對海南的主栽品種‘福橙和‘綠橙。過去主要是通過肉眼判別和普通PCR的方法對海南地區(qū)的柑橘黃龍病進行鑒定，本文通過Quantitative PCR和RT-PCR的方法對隨機采集的海南‘福橙和‘綠橙樣品進行柑橘黃龍病及柑橘病毒病的檢測，同時結合相應的田間調研，對目前海南柑橘產業(yè)面臨的問題進行綜合分析和闡述，旨為政府部門或相關生產單位柑橘生產安全和病害綜合防控提供參考，以利于海南柑橘產業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和果園基本情況

柑橘樣品采集時間分別為2017年3月、12月。采自海南‘福橙、‘綠橙的主要種植區(qū)域。

澄邁縣福山鎮(zhèn)澄邁‘福橙標準化種植示范基地： 種植當地繁育的無病種苗，2015年10月種植，種植時間約2年，共28.67 hm2，2萬多株，田間管理中上水平，有水肥滴灌系統(tǒng)，水肥中上，長勢正常，株高0.8～1.5 m，未掛果，未見黃龍病癥狀或黃化癥狀樹。

澄邁縣福山鎮(zhèn)東義‘福橙種植園：2015年初種植，來自外地繁育的無病種苗，種植約3年，面積約0.8 hm2，700株左右，田間管理優(yōu)良，有水肥滴灌系統(tǒng)，水肥充足，長勢優(yōu)良，枝梢生長旺盛，開花掛果優(yōu)良，已是第二年桂果，株高1.5～2.5 m，個別植株生長明顯變差，果實變小且可見黃龍病癥狀或黃化癥狀樹。

澄邁縣福山鎮(zhèn)紅湖農場‘福橙種植園：2013年10月種植，種植約5年，原種植約5 000株，因黃龍病危害目前僅剩約2 000株，田間管理中下，水肥中下，長勢較差，株高1.5～2 m，開花中等，掛果不多，多見黃龍病癥狀或黃化癥狀樹。

瓊中縣和平鎮(zhèn)‘綠橙種植基地的3個果園：種植約為10年，由政府統(tǒng)一規(guī)劃種植后分別由不同農戶管理。果園1和果園3，黃龍病發(fā)生較為嚴重，且田間管理差，水肥差，果樹長勢差，枝梢較纖細，落葉較多，樹冠較低、稀疏，株高2～3 m，開花不良，掛果極少，多見黃龍病癥狀或黃化癥狀;果園2，黃龍病發(fā)生較為嚴重，但逐年清除病樹，田間管理中上，水肥中上，果樹長勢正常，株高2～3 m，開花掛果正常，株產正常，但果園仍可見黃龍病癥狀或黃化癥狀樹。

瓊中縣營根鎮(zhèn)‘綠橙種植園：該園為‘綠橙新植園，2017年初種植，種植約1年，田間管理中等，水肥中等，長勢正常，株高約0.5～0.8 m，未掛果，未見黃龍病癥狀或黃化癥狀。

采用五點采樣法隨機采集109個樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 柑橘DNA和RNA的提取、檢測及RNA的反轉錄

DNA和RNA的提?。好糠軩NA和RNA樣品均采集2～3個柑橘葉片中脈（或者取柑橘果實）0.5 g左右，用刀片切碎，而后用液氮快速將樣品磨碎，依次類推。每個樣品單獨用一副手套、一個研缽和研磨棒。本文中DNA的提取嚴格按照試劑盒說明書進行提取，試劑盒為（AXYGEN）愛思進動植物基因組DNA制備試劑盒，具體提取方法詳見試劑盒說明書。RNA的提取主要采用天根生化科技有限公司的RNA提取試劑盒（貨號DP441，RNAprep Pure Plant Plus Kit），具體操作詳見試劑盒說明書。

DNA和RNA的檢測：取2 μL樣品在超微量紫外/可見分光光度計（Nano-100）儀器上進行檢測，讀取并記錄DNA和RNA的含量和質量數值。RNA的反轉錄：具體操作見天根生化科技有限公司反轉錄試劑盒說明書[貨號：KR116-02，FastKing RT Kit （with gDNAase）]。

1.2.2 柑橘黃龍病菌的檢測

本研究采用實時熒光定量PCR（Quantitative PCR）的方法對柑橘葉片及柑橘果實中的黃龍病菌進行檢測。所有檢測試驗均在ABI PRISM 7500 （Applied Biosystems， Foster City， CA， USA）上進行。同時以柑橘黃龍病亞洲種的部分16S rDNA序列為模板設計引物， 引物的設計主要參照Li 等的文章[11]：HLBas：5′-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3′，HLBr：5′-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3′，利用探針HLBp： 5′-6-carboxy-fluorescein （FAM）-AGACGGGTGAGTAACGCG-Black Hole Quencher（BHQ）-1-3′對樣品進行檢測。所用試劑為TaKaRa公司的Premix Ex Taq （Probe qPCR），所用引物和探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。實時熒光定量PCR所用試劑如下（25 μL）： 12 μL Premix Ex Taq （Probe qPCR），0.5 μL HLBas/HLBr，1 μL HLBp，1 μL DNA（50 ng/μL），10 μL dd H2O。具體程序為：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s 40個循環(huán)。程序運行結束后，讀取Ct值。本團隊利用標準品得到的Ct值與菌含量的關系為：Y=-0.286X+11.924，其中X為Ct值，Y為拷貝數，每克植物組織中含有的病原菌拷貝數為10Y。

1.2.3 柑橘病毒病的檢測

為了對海南省主要‘福橙和‘綠橙產區(qū)橘園內的主要柑橘病毒病進行分析，根據已有參考文獻中的檢測引物，重點對柑橘衰退病、裂皮病、褪綠矮縮病、碎葉病和黃脈病進行檢測[1214]， 具體引物序列見表1。以反轉錄獲得的cDNA為模板，進行PCR反應，具體體系如下（20 μL）： Premix Ex Taq 10 μL，上/下游引物各 0.5 μL， cDNA（50 ng/μL） 1 μL， ddH2O 8 μL;具體程序如下：95℃ 5 min; 94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán);72℃ 5 min。 16℃保持。PCR結束后進行電泳，根據條帶的有無對結果進行總結和分析。

2 結果與分析

2.1 海南‘福橙、‘綠橙主要產區(qū)柑橘黃龍病檢測結果及發(fā)病情況

本研究采用熒光定量PCR（QPCR）方法分別在2017年春冬季對隨機采自澄邁縣和瓊中縣7個果園共109個柑橘樣品進行柑橘黃龍病含量檢測：其中‘福橙果園3個，樣品共計56個;‘綠橙果園4個，樣品共計53個，具體結果見表2。從表2中可以看出，澄邁縣‘福橙標準化種植示范基地的柑橘黃龍病處于感病初期，2017年3月抽檢樣品的檢出率為100%，平均菌含量很低，僅為（1.14±1.79）×103拷貝/g，2017年12月的檢出率僅為8.3%;紅湖農場種植園在2017年3月和12月的2次抽檢中，葉片和果實樣品的檢出率均為100%;東義‘福橙示范基地2017年3月抽檢葉片樣品的檢出率為100%，2017年12月葉片和果實樣品的檢出率均為88%。2017年3月對瓊中縣和平鎮(zhèn)3個‘綠橙種植園的葉片抽檢結果顯示，3個果園柑橘黃龍病的檢出率均為100%;2017年12月‘綠橙種植園1和3黃龍病的檢出率為100%，‘綠橙種植園2為75%。2017年12月新增抽檢果園營根鎮(zhèn)‘綠橙種植園的檢出率僅為11%。從表2中我們可以看出，來自澄邁縣‘福橙標準化種植示范基地[（1.14±1.79）×103拷貝/g]和瓊中縣營根鎮(zhèn)‘綠橙種植園[（0.03±0.05）×103拷貝/g]的樣品含菌量遠遠低于其他被檢果園樣品的含菌量。究其原因，黃龍病不同發(fā)病程度可能與種植年限相關，從表中可以看出澄邁縣‘福橙標準化種植示范基地為種植當地種苗2年左右的新植園，瓊中縣營根鎮(zhèn)‘綠橙種植園為種植不足1年的新植園。值得注意的是，同為種植2年左右的果園，東義種植園柑橘黃龍病的檢出率為88%以上，遠遠高于‘福橙標準化種植示范基地;同時前者的平均菌含量為后者的100倍以上。這些現象提示我們，黃龍病的發(fā)病程度除與種植年限有關外還與果園的田間栽培管理水平相關。

2.2 海南‘福橙、‘綠橙主要產區(qū)柑橘病毒病的檢測結果及發(fā)病情況

研究表明，除柑橘黃龍病外，柑橘病毒病也嚴重影響柑橘生長和產量。本研究采用RT-PCR方法對柑橘樣品中5種柑橘病毒病（柑橘衰退病、柑橘裂皮病、柑橘褪綠矮縮病、柑橘碎葉病及柑橘黃脈?。┻M行檢測。結果表明，7個橘園均未檢測到柑橘褪綠矮縮病毒;澄邁縣3個‘福橙橘園都檢出了柑橘衰退病毒（檢出率分別為52.9%、100%、95.2%）、柑橘碎葉病毒檢出率分別為41.2%、55.6%、38.1%）和柑橘黃脈病毒（檢出率分別為100%、83.3%、85.7%）;除此之外，‘福橙標準化種植示范基地和東義‘福橙示范種植園還檢出了柑橘裂皮病毒（檢出率分別為11.8%和71.4%），而紅湖農場‘福橙種植園未檢出（表3）。

2017年12月采自瓊中縣4個‘綠橙橘園的柑橘葉片和果實均未檢測到柑橘褪綠矮縮病毒和柑橘碎葉病毒;但都檢出了柑橘衰退病毒（檢出率分別為100%、93.8%、87.5%、77.8%）和柑橘黃脈病毒（檢出率分別為90%、93.8%、93.8%、100%）。此外，和平鎮(zhèn)‘綠橙橘園果園3的葉片和果實樣品中還檢出了柑橘裂皮病毒（檢出率為43.8%）。具體結果見表2。

3 討論

海南省是我國重要的亞熱帶水果產區(qū)之一，終年雨水充沛、長夏無冬、光熱豐富，有利于亞熱帶作物的生長。除此之外，海南省全境屬熱帶地區(qū)，占全國熱帶面積的42.5%，其中種植熱帶作物的面積占全省的23.9%，非常適合發(fā)展熱帶特色作物[15]。澄邁縣位于海南北部丘陵臺地，瓊中縣位于海南中部山地丘陵，都非常適合發(fā)展熱帶水果產業(yè)，兩地均為海南省主要的柑橘產區(qū)。

結合本次收集到的7個果園的田間信息和分子檢測結果發(fā)現，除種植年限較短的橘園，如澄邁縣‘福橙標準化種植示范基地和瓊中縣營根鎮(zhèn)‘綠橙柑橘黃龍病檢出率和發(fā)病程度較輕外，其他橘園的柑橘黃龍病發(fā)病均較嚴重。值得注意的是，澄邁縣福山鎮(zhèn)東義‘福橙種植園同為種植年限較短的橘園，柑橘黃龍病的檢出率已經達到了88%，發(fā)病程度也很嚴重（表2）;經查，該橘園的種苗來自外地繁育的無病種苗。同時對7個橘園柑橘病毒病的檢測發(fā)現，新植園與老橘園在病毒病的發(fā)生種類上不存在差異，僅在檢出率上有少許差距（表3）。這些現象暗示我們除了加強對橘園的水肥、除蟲除草等田間管理外，加強種苗的檢測，減少柑橘黃龍病和病毒病對柑橘苗木的污染源頭也非常重要。

以往的調研報道表明，瓊中地區(qū)樣品柑橘黃龍病的檢出率均小于100%，約為60%左右[16];在本次調研中采自瓊中縣和平鎮(zhèn)3個種植園的樣品柑橘黃龍病檢出率均超過了75%，雖然在隨機采樣中會有一定的不確定因素存在，但也從側面說明柑橘黃龍病在這些地區(qū)的危害程度正在進一步加重。從表2可以看出，澄邁縣福山鎮(zhèn)的3個果園，3月采集的柑橘葉片含菌量平均高出12月葉片樣品的2倍以上，但是12月采集的果實樣品中的含菌量遠超同期葉片中的含菌量。由于3月采自瓊中和平鎮(zhèn)果園的樣品為種植園1、種植園2和種植園3的混樣，因此無法比較不同季節(jié)單一果園的含菌量。但是12月采自種植園2和種植園3的果實樣品含菌量遠超同果園葉片的含菌量。種植園1由于年久失管，果實小而且量極少，因此大量黃龍病菌仍存在于葉片中。這些現象暗示我們柑橘果園中12月（冬季）的黃龍病菌濃度遠高于3月（春天）的黃龍病菌濃度;同時當柑橘植株掛果后，隨著果實接近成熟存在柑橘黃龍病從葉片向果實轉移的現象。以上這些結論仍需要進一步的試驗進行驗證。

基于本次調研中7個果園的具體情況，本文建議采取分類防控措施：1）澄邁縣福山鎮(zhèn)紅湖農場‘福橙種植園和瓊中縣和平鎮(zhèn)‘綠橙果園1和果園3不但柑橘黃龍病發(fā)生嚴重，而且處于失管狀態(tài)或管理不善，需進行徹底挖除清園，并火燒處理被挖樹體，進行整體重新規(guī)劃重新種植或改種;2）澄邁縣福山鎮(zhèn)東義‘福橙示范基地和瓊中縣和平鎮(zhèn)‘綠橙果園，雖然柑橘黃龍病發(fā)病嚴重，但果園管理優(yōu)良也有良好經濟產量和產值，需對果園加強監(jiān)測，并對園中的病樹采取徹底挖除，火燒處理被挖樹體，同時可補種無病柑橘大苗（這樣可以縮短柑橘結果前暴露在田間的時間，同時能夠讓果農盡快獲得收益）[18];3）對于一些發(fā)病較輕、種植年限較短的橘園，如澄邁縣‘福橙標準化種植示范基地和瓊中縣營根鎮(zhèn)‘綠橙種植園，側重于采取防病與防蟲相結合、化學藥劑與生物防治相結合的方法，在柑橘樹抽梢期等特殊時期進行藥劑噴灑，減少木虱數量;將四環(huán)素等抗生素通過輸液的方式輸送到柑橘樹體內，可有效遏制柑橘黃龍病的發(fā)展，減少樹體內病原菌的數量;增強樹勢，增加新梢，增加掛果等;4）對于需種植柑橘苗木的新植園，嚴格把控柑橘種苗的質量，加強對種苗柑橘黃龍病和病毒病的檢測檢疫，同時對果園不定期噴施殺蟲殺菌藥劑，加強柑橘不同生長時期木虱的防控力度，減少柑橘黃龍病的傳播媒介;科學進行水肥管理，增強樹勢，提高樹體的營養(yǎng)水平和自身抗病蟲能力等。

綜上所述，柑橘黃龍病和病毒病已經對海南省柑橘主產區(qū)澄邁縣和瓊中縣的柑橘造成了嚴重的危害，發(fā)展和建立規(guī)范的無病種苗生產基地并加強柑橘種苗的檢測檢疫以及田間柑橘果園的栽培管理，有助于海南省減輕柑橘黃龍病和柑橘病毒病的發(fā)生和危害。

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（責任編輯：楊明麗）