不同葡萄糖濃度對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育影響

豆昌鳳，周 鑫，程小翠，李歡歡，趙彩霞，俞海洋，王 榮，張 迪

（阜陽(yáng)師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037）

隨著人們生活水平的提高，對(duì)糖類的攝取量也不斷增多，再加上遺傳和環(huán)境因素的影響，全球糖尿病的發(fā)病率仍然居高不下，育齡期婦女糖尿病的發(fā)病率也不斷增高[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球懷孕的女性中有大約1.7%～11.6%患有糖尿病，這也使得胎兒患有各種先天性缺陷[2]。胚胎發(fā)育受到眾多因素的影響，其內(nèi)在機(jī)制是非常復(fù)雜的，但葡萄糖作為一種關(guān)鍵的能源提供者對(duì)胚胎發(fā)育發(fā)揮著巨大的調(diào)控作用。葡萄糖可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，也有抑制作用。在許多體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖濃度影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[3]。高血糖通常與各種代謝紊亂相關(guān)，往往伴隨著生育率的降低。與糖尿病有關(guān)的女性不孕是由于高葡萄糖水平對(duì)發(fā)育胚胎的有害影響[4]。

研究認(rèn)為，對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎，過(guò)量的葡萄糖會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，影響其發(fā)育，甚至導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯[3]。雖然在胚胎發(fā)育的生殖道環(huán)境中存在著一些關(guān)于葡萄糖濃度的爭(zhēng)議。但發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度比血糖正常血清(5.56 mM)高3～4倍，這會(huì)損害胚胎發(fā)育。在小鼠模型中，植入前胚胎在含有15～27 mM葡萄糖(是正常小鼠血清的2～3倍)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會(huì)損害囊胚的擴(kuò)張和孵化[6]。體外研究進(jìn)一步表明，高糖濃度損害了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和產(chǎn)婦高血糖影響后代細(xì)胞凋亡，增殖，遷移和分化過(guò)程中的基因表達(dá)[7]。

PTGFR基因編碼的蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，是前列腺素F2-α(PGF2-alpha)的受體，前列腺素通過(guò)與其受體PTGFR結(jié)合在生殖、血壓、以及骨重塑方面PGF2α發(fā)揮廣泛的病理和生理功能，PTGFR在生殖發(fā)育相關(guān)部位如子宮內(nèi)膜、卵巢、胚胎中表達(dá)較多，且有研究表明，糖尿病患者循環(huán)中前列腺素(PG)F2α水平也明顯升高，PGF2α受體(PTGFR)在空腹和糖尿病應(yīng)激小鼠的肝臟中表達(dá)上調(diào)[8-9]；血小板活化因子(PTAFR)是一種由植入前產(chǎn)生的有效的信號(hào)磷脂，于1972年首次報(bào)道[10]，PTAFR參與了許多生殖和發(fā)育過(guò)程[11-12]，包括排卵[13-14]、著床前胚胎發(fā)育[15]、植入[16]和分娩[17]。皮素A受體(EDNRA)的激活在糖尿病微血管病變中起重要作用；EDNRA的激活在糖尿病微血管病變中起重要作用，有報(bào)道糖尿病孕婦血漿ET-1水平在整個(gè)觀察期明顯高于健康孕婦[18]；尾加壓素II（UTS2R）是已知的最有效的血管活性激素之一[19]；速激肽受體3(TACR3)基因編碼神經(jīng)激肽3(NK3)受體，是一種G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，通過(guò)多種信號(hào)途徑發(fā)揮其多種生理作用，在胎盤(pán)中有表達(dá)。這5個(gè)基因與發(fā)育和生殖相關(guān)，其變化會(huì)引起編碼蛋白發(fā)生變化。

本研究通過(guò)體外培養(yǎng)方法，分析了在不同濃度葡萄糖環(huán)境下小鼠植入前胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，使用定量熒光PCR方法分析胚胎發(fā)育相關(guān)基因(PTGFR，PTAFR，EDNRA，TACR3，UTS2R)表達(dá)水平的變化，試圖發(fā)現(xiàn)葡萄糖對(duì)早期胚胎體外發(fā)育產(chǎn)生的影響及可能途徑，為探究孕婦糖尿病對(duì)胚胎發(fā)育影響提供思路，為胚胎技術(shù)、臨床輔助生殖提供必要的實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用清潔級(jí)的8 w昆明白雌性小鼠和8～10 w昆明白雄性小鼠。購(gòu)買自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；保持12 h光周期，控制溫度在18～23℃，相對(duì)濕度60%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和藥品

葡萄糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，白色粉末；配制M2操作液，ksom培養(yǎng)基和HTF獲能液的各試劑均購(gòu)自Sigma公司，孕馬血清促性腺激素(pregnant mare timulationgonadotropin，PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)，購(gòu)自寧波第二激素廠，胚胎培養(yǎng)級(jí)水購(gòu)自HyClone；生理鹽水購(gòu)自國(guó)藥；RNase抑制劑購(gòu)自TIANDZ；一步法定量試劑盒購(gòu)自Takara；其他藥品若無(wú)特殊說(shuō)明，均購(gòu)自Sigma。

1.3 主要儀器

眼科鑷，尖頭剪，倒置顯微鏡(德國(guó)Leica，DMI3000B)，二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo，3141)，小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)eppendorf，5417R)，分析天平(梅特勒，XS205DU)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化，SW-CJ-2E)，藥品恒溫冷藏柜(SANYO，MDR-411FR)，定量 PCR 儀（ABI，StepOnePlus）。

1.4 動(dòng)物的超數(shù)排卵

選取8～10 w的KM雌鼠和8～10 w的KM雄鼠，腹腔注射10 IU的PMSG，46～48 h腹腔注射10 IU的HCG，12 h后體外受精。

1.5 小鼠MII卵收集、體外受精及胚胎體外培養(yǎng)

在注射hCG后12 h左右，將雄鼠用頸椎脫臼法處死，取75%酒精消毒腹部后，打開(kāi)腹腔，剪下附睪尾迅速將其置于預(yù)溫的HTF獲能液中，于解剖鏡下用剪刀剪開(kāi)，使精子流出，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；接著以同樣的方法處死雌鼠，并取出輸卵管，放入M2操作液中，置于顯微鏡下用尖頭鑷將輸卵管壺腹部明顯膨大處穿破，使卵丘-卵子復(fù)合體流出，然后放入獲能液中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注射hCG14 h后取60 μL精子加入卵子獲能體系中，4～5 h后用操作液M2并在解剖鏡下觀察，選有雙原核的受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)。。

1.6 胚胎培養(yǎng)

在四孔板的每個(gè)孔中分別加入含0、5.5、27.5 mmol·L-1葡萄糖的 KSOM 培養(yǎng)液，每孔 30～40 個(gè)胚胎。在飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)平衡培養(yǎng)液，胚胎在37℃、5%CO2和飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)4 d。觀察各時(shí)期胚胎并記錄。計(jì)算2-細(xì)胞率、4-細(xì)胞率、桑甚胚率、囊胚率。

1.7 定量PCR

收集各組的囊胚到1.5 mL離心管中，每管5個(gè)，用5 μL裂解液裂解，可-80℃凍存。用Takara公司一步法定量PCR試劑盒檢測(cè)PTGFR，PTAFR，EDNRA，TACR3，UTS2R?；虮磉_(dá)變化采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。以Gapdh為內(nèi)參基因[20]。引物信息見(jiàn)表1。

表1 5個(gè)基因引物序列

定量PCR中的各參數(shù)按照標(biāo)準(zhǔn)流程設(shè)定，采用Takara公司的一步方法執(zhí)行。即42℃5 min，95℃10 s反轉(zhuǎn)錄，然后 95℃5 s，60℃30 s，50次循環(huán)。結(jié)束時(shí)執(zhí)行溶解曲線檢測(cè)分析。每3枚囊胚用于一個(gè)PCR反應(yīng)體系，重復(fù)三次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0對(duì)各期胚胎形成率差異進(jìn)行分析單因素方差分析，p＜0.05未顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度葡萄糖對(duì)胚胎發(fā)育的影響

將體外受精胚胎置于含有不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液中在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，探究葡萄糖對(duì)胚胎發(fā)育影響。發(fā)育情況如圖1所示。統(tǒng)計(jì)各期胚胎發(fā)育情況。由表2與圖2知，與5.5 mM濃度葡萄糖對(duì)照組比較，無(wú)糖組及高塘組2-細(xì)胞率、4-細(xì)胞率和桑椹胚率無(wú)明顯差異(p＞0.05)，囊胚率明顯降低(p＜0.05)。

各組胚胎2-細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，見(jiàn)圖1a～c。光鏡下受精后26 h的無(wú)糖培養(yǎng)液培養(yǎng)2-細(xì)胞、對(duì)照2-細(xì)胞和高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的2-細(xì)胞圖。2-細(xì)胞率與受精有著密切關(guān)系，光鏡下并沒(méi)有觀察到高糖影響下的胚胎出現(xiàn)異常，各組胚胎發(fā)育率分別為95.5%，95.25%，93.75%。

各組中2-細(xì)胞胚胎的形態(tài)學(xué)觀察，見(jiàn)圖1a～c。受精后26小時(shí)的無(wú)糖培養(yǎng)液中的2-細(xì)胞胚、對(duì)照2-細(xì)胞胚和高糖培養(yǎng)液中的2-細(xì)胞胚圖。光鏡下并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高糖導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)發(fā)育異常，各組胚胎發(fā)育率分別為 95.5%，95.25%，93.75%。

各組中4-細(xì)胞胚胎形態(tài)學(xué)觀察，見(jiàn)圖1d～f。受精后48小時(shí)的無(wú)糖培養(yǎng)液中4-細(xì)胞胚、對(duì)照組4-細(xì)胞胚和高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的4-細(xì)胞胚圖。光鏡下同樣未發(fā)現(xiàn)高糖影響胚胎形態(tài)出現(xiàn)異常，但各組胚胎發(fā)育率出現(xiàn)差異，分別為90%，93.25%，82.25%。

各組胚胎囊胚形態(tài)學(xué)觀察，見(jiàn)圖1j～l。光鏡下無(wú)糖培養(yǎng)液培養(yǎng)囊胚、對(duì)照組囊胚和高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的囊胚圖。各組胚胎發(fā)育率分別為51.25%，73.75%，52.25%。正常培養(yǎng)液中囊胚率在70%以上，無(wú)糖培養(yǎng)液培養(yǎng)囊胚、高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的胚胎囊胚率顯著降低。

從表2的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胚胎在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，胚胎在2-cell，4-cell，各階段的發(fā)育與正常組比較沒(méi)有顯著性改變，而胚胎在桑椹胚開(kāi)始受到明顯抑制，胚胎囊胚形成率下降受到顯著抑制。各組胚胎都能順利地發(fā)育通過(guò)2-cell，4-cell階段，主要的發(fā)育受抑制期表現(xiàn)為桑椹胚后階段。

2.2 不同葡萄糖對(duì)胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

為本工作特別挑選了5個(gè)已知的在小鼠具有關(guān)鍵作用的基因進(jìn)行表達(dá)分析，探究葡萄糖在分子水平對(duì)胚胎發(fā)育的影響，這五個(gè)基因分別是PTGFR、PTAFR、EDNRA、TACR3、UTS2R。利用定量PCR方法，比較并分析了它們?cè)? mM、5.5 mM、27.5 mM條件下發(fā)育形成囊胚中的表達(dá)。5個(gè)基因的表達(dá)情況見(jiàn)圖3?？梢钥闯?，與對(duì)照組相比，五個(gè)基因分別是PTGFR、PTAFR、EDNRA、TACR3和UTS2R的表達(dá)都有變化，低糖濃度下PTGFR的表達(dá)降低，但沒(méi)有受到顯著影響，但是高糖濃度下PTGFR的表達(dá)顯著升高；與之相反的是EDNRA的表達(dá)情況，低糖濃度下EDNRA的表達(dá)顯著升高，高糖濃度下EDNRA的表達(dá)降低，但沒(méi)有受到顯著影響；而另外3個(gè)基因PTGFR、TACR3和UTS2R的表達(dá)在葡萄糖存在的情況下都發(fā)生了改變，高糖和低糖情況下表達(dá)量增加，呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。其中TACR3在低糖濃度下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，但是沒(méi)有顯著增加，在高糖濃度下Tacr3表達(dá)受到葡萄糖的明顯影響，表達(dá)量顯著增加；與TACR3的表達(dá)情況相反的是，低糖情況下，表達(dá)量顯著增加呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，高糖濃度下PTAFR表達(dá)明顯增加、UTS2R的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)但不顯著。

圖1 不同葡萄糖濃度體外培養(yǎng)條件下小鼠胚胎圖

表2 不同濃度葡萄糖對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育影響

圖2 不同葡萄糖濃度體外培養(yǎng)條件下小鼠胚胎發(fā)育

圖3 5個(gè)基因在不同葡萄糖濃度體外培養(yǎng)條件下小鼠囊胚中的差異表達(dá)

3 討論

孕婦體內(nèi)異常糖含量會(huì)導(dǎo)致一系列問(wèn)題，流產(chǎn)、畸形、巨大胎兒、先天性器官畸形等，胚胎發(fā)育受到眾多因素的影響，其內(nèi)在機(jī)制是非常復(fù)雜的。葡萄糖可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，也有抑制作用。孕期高血糖會(huì)升高氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生的大量超氧自由基對(duì)胚胎造成損害[21]。在卵裂前期，即8-細(xì)胞之前的階段，主要的供能物質(zhì)是丙酮酸，當(dāng)發(fā)育到8-細(xì)胞胚時(shí)，葡萄糖成為主要的供能物質(zhì)[22]，對(duì)胚胎發(fā)育發(fā)揮著巨大的調(diào)控作用，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是吻合的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)體系中添加葡萄糖體外培養(yǎng)胚胎，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葡萄糖濃度對(duì)胚胎發(fā)育有顯著影響，低糖、高糖環(huán)境下葡萄糖阻礙了胚胎的發(fā)育，尤其是從桑椹胚到囊胚階段的發(fā)育。為了保證胎兒的正常發(fā)育，調(diào)節(jié)控制孕婦體內(nèi)糖含量非常重要[23]。已證明胚胎受高糖影響，細(xì)胞凋亡是一個(gè)及其復(fù)雜的程序化過(guò)程。實(shí)際上，許多與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因都在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。葡萄糖濃度影響基因的表達(dá)，我們認(rèn)為PTGFR、PTAFR、EDNRA、TACR3、UTS2R參與了高濃度葡萄搪誘導(dǎo)的著床前胚胎細(xì)胞的凋亡，胚胎發(fā)育相關(guān)基因PTGFR、PTAFR、EDNRA、TACR3、UTS2R在囊胚形成和胚胎植入過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。研究指出，PG受體在哺乳動(dòng)物排卵、黃體退化、胚胎著床和分娩等生殖過(guò)程,發(fā)揮著關(guān)鍵而復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，PTGFR（前列腺素F2α受體）是識(shí)別子宮內(nèi)膜妊娠的胚胎信號(hào)受體[24]，抑制其合成會(huì)導(dǎo)致物種在植入前終止妊娠，有研究表明證明PTGFR在空腹和糖尿病應(yīng)激小鼠的肝臟中表達(dá)上調(diào)，本實(shí)驗(yàn)與之結(jié)果是相吻合的。EDNRA（endothelin receptor type A）內(nèi)皮素受體A型該基因編碼內(nèi)皮素-1的受體，是Endothelin的G蛋白偶聯(lián)受體，內(nèi)皮素-1是一種在強(qiáng)效和持久的在血管收縮中起作用的肽。該受體與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合（G）蛋白結(jié)合，這種偶聯(lián)激活磷脂酰肌醇-鈣第二信使系統(tǒng)。研究表明EDNRA(內(nèi)皮素受體A型)也參與生殖活動(dòng)調(diào)節(jié)，可通過(guò)自分泌或旁分泌對(duì)胚胎發(fā)生和早期胚胎發(fā)育起到調(diào)控作用[25]。TACR3(速激肽受體3)在調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素的釋放中發(fā)揮重要作用，是人類正常生殖發(fā)育和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，TACR3在生殖內(nèi)分泌調(diào)控中的作用不容忽視[26]，在高糖處理組中，該基因表達(dá)上調(diào)。PTAFR是血小板激活因子受體即PAF受體，研究表明較高水平PAF可以提升妊娠率，因此在人類生殖過(guò)程如排卵、受精、著床等中發(fā)揮重要作用[27]，培養(yǎng)基中添加PTAFR促進(jìn)胚胎代謝、減少胚胎細(xì)胞死亡的發(fā)生率，同時(shí)提高體外發(fā)育率，可作為哺乳動(dòng)物著床前胚胎的自分泌生長(zhǎng)/存活因子之一，然而在本研究中，實(shí)驗(yàn)組中該基因表達(dá)量上調(diào)，推測(cè)在實(shí)驗(yàn)組中胚胎為了存活，會(huì)增加PTAFR的表達(dá)，從而使胚胎發(fā)育到囊胚。查閱文獻(xiàn)可知UTS2R(尾加壓素Ⅱ受體)在血管收縮方面發(fā)揮作用，對(duì)增加遷移、粘附和體外血管生成等有顯著影響[28]。與對(duì)照組相比，PTAFR、EDNRA、TACR3和UTS2R下在低糖濃度下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。在高糖濃度下PTGFR、PTAFR、TACR3和UTS2R呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。證明了在基因表達(dá)水平上，葡萄糖對(duì)胚胎發(fā)育存在影響證明了在基因表達(dá)水平上孕婦高糖對(duì)胚胎發(fā)育影響的存在。盡管對(duì)葡萄糖調(diào)節(jié)PTGFR、PTAFR、EDNRA、TACR3和UTS2R基因表達(dá)的途徑與機(jī)制還不清楚，但我們可以認(rèn)為它是通過(guò)包括滲透壓、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和表觀遺傳修飾，氧化應(yīng)激等多種途徑實(shí)現(xiàn)的[29]。

葡萄糖具體通過(guò)哪條途徑影響胚胎發(fā)育,尚有待進(jìn)一步研究。本文系統(tǒng)的分析葡萄糖的濃度對(duì)胚胎發(fā)育的影響，葡萄糖濃度對(duì)胚胎發(fā)育的規(guī)律。闡明影響胚胎發(fā)育的葡萄糖濃度效應(yīng)及影響發(fā)育的關(guān)鍵階段。說(shuō)明母體糖尿病對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響，為了胎兒的正常發(fā)育，應(yīng)控制發(fā)育環(huán)境中的葡萄糖濃度。本研究可以為提高哺乳動(dòng)物胚胎體外培養(yǎng)效率提供一定的實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)，也可為人類臨床輔助生殖提供研究思路，為解決孕婦高糖促成致畸的這些因素提供參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)于后期建立小鼠模型以進(jìn)一步研究與糖尿病誘導(dǎo)的胚胎病變相關(guān)的潛在機(jī)制是重要的。

4 小結(jié)

哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，胚胎早期階段的細(xì)胞譜系的正確建立是整個(gè)后期發(fā)育的基礎(chǔ)。本研究探討了糖濃度對(duì)胚胎發(fā)育的影響，研究的結(jié)果證明了糖濃度可以極大地影響胚胎的早期發(fā)育和發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)。不但幫助理解環(huán)境因素在胚胎發(fā)育上的影響，更有助于為防止胎源性疾病及先天畸形的發(fā)生提供理論研究基礎(chǔ)。