不同批次廣東王不留行蘆丁和綠原酸的含量比較

袁德俊，吳 涵，梁馨文，黃曉冰

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510240；2.中山大學(xué)新華學(xué)院，廣東 廣州 510520）

廣東王不留行為?？浦参镛道螅‵icuspumila L.）的干燥癮頭花序托，別名為薜荔果、木蓮、絡(luò)石藤、風(fēng)不動(dòng)、常春藤等，主產(chǎn)于廣東、廣西、湖南、江西等地，具有祛風(fēng)利濕、活血解毒的功效，用于風(fēng)濕痹痛、瀉痢、淋病、跌打損傷、癰腫瘡癤的治療［1］。《中華人民共和國(guó)藥典》記載的王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜Vacaria Segetalis（Neck）Carcke的干燥成熟種子 ，具有活血通經(jīng)、下乳消腫的功效，主治痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后乳汁不下及乳癰腫痛等［2］，是全國(guó)使用和流通的王不留行的正品。然而，廣東、廣西等地區(qū)習(xí)慣將廣東王不留行當(dāng)作王不留行使用［3］，事實(shí)上兩者在來(lái)源、用藥部位及功效等方面差異都較大。有關(guān)廣東王不留行化學(xué)成分的文獻(xiàn)研究不多，有報(bào)道其花序托含蘆丁、內(nèi)消旋肌醇、蕓香苷、β-谷甾醇等成分［1］，曾頌等［4-5］學(xué)者對(duì)其槲皮素、蘆丁和綠原酸的含量進(jìn)行了測(cè)定。為對(duì)廣東王不留行的藥材質(zhì)量進(jìn)行更深入的研究，本研究采用HPLC同時(shí)測(cè)定廣東王不留行中蘆丁和綠原酸的含量，并對(duì)不同批次、不同廠家的含量進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津，型號(hào)為L(zhǎng)C-20AT）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析公司，型號(hào)為T(mén)U-1901）；電子天平（北京普析公司，型號(hào)為MSE125P-OCE-DU）；超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量為96.8%，批號(hào)：110753-201817）；蘆丁對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，含量＞98%，批號(hào)：L-001-170426）；乙腈（色譜純）；其余試劑均為分析純。10批次廣東王不留行批號(hào)及收集地分別為：1608001（嶺南）、170304001（清平市場(chǎng)）、170301（至信）、1705001（嶺南）、170304002（清平市場(chǎng)）、1701001（嶺南）、170304003（清平市場(chǎng)）、160801（至信）、161101（至信）、1808001（嶺南），產(chǎn)地均為廣東，經(jīng)吳康郁副主任中藥師鑒定為桑科植物薜荔的干燥癮頭花序托的炮制加工品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品5.50 mg，置25 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液（228μg/ml）；精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品5.48 mg，置25 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液（219μg/ml）。精密量取上述儲(chǔ)備液各1 ml置于5 ml量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻即得混合對(duì)照品溶液（蘆丁和綠原酸濃度分別為45.6 μg/ml、43.8 μg/ml）。

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1.00 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SPC18柱（150mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫的情況見(jiàn)表1；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：251 nm；液相色譜柱溫度：30℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10μl；理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)應(yīng)不低于3 000［6］。精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果蘆丁和綠原酸與其他成分能得到較好的分離，其分離度均大于1.5。見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密量取上述綠原酸對(duì)照儲(chǔ)備液 0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml和上述蘆丁對(duì)照儲(chǔ)備液 0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，分別置于對(duì)應(yīng)5個(gè)10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋定容至刻度，搖勻，即得各混合對(duì)照品系列溶液。分別精密吸取上述各混合對(duì)照品系列溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述含量測(cè)定方法測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制綠原酸和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸的回歸方程為：Y=12 171X-6 537（r2=0.9993）；蘆丁的回歸方程為：Y=17 196.1X-2 315.36（r2=0.9995）。綠原酸和蘆丁分別在9.60～76.80μg/ml和4.08～20.40μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取10μl綠原酸和蘆丁的混合對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)得綠原酸的峰面積RSD為1.23%（n=6），蘆丁的峰面積RSD為1.06%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述含量測(cè)定方法，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h取10 μl樣品進(jìn)樣測(cè)定，同時(shí)記錄不同時(shí)間下對(duì)應(yīng)的峰面積，并根據(jù)峰面積計(jì)算出樣品中綠原酸和蘆丁的濃度。結(jié)果顯示綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.45%（n=7）和0.46%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 選取同一批廣東王不留行藥材（批號(hào)：161101）6份，按2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果綠原酸平均含量為45.79 μg/ml，RSD為1.89%（n=6）；蘆丁平均含量為7.05μg/ml，RSD為2.27%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取6份廣東王不留行供試品（含量已知），分別稱(chēng)取1.00 g，并加入不同質(zhì)量的綠原酸和蘆丁對(duì)照品，在2.1色譜條件下每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次計(jì)算樣品的回收率，見(jiàn)表2。

表2 綠原酸、蘆丁加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 綠原酸、蘆丁的含量測(cè)定 取不同收集地、不同批次的廣東王不留行樣品，按2.2方法制備供試品溶液，并按2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較不同比例的流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），發(fā)現(xiàn)按表1所示比例進(jìn)行梯度洗脫，能使廣東王不留行中綠原酸和蘆丁得到較好的分離效果。此外，超聲提取法提綠原酸和蘆丁較煎煮法、乙醇回流法在操作上更簡(jiǎn)便，且提取率較高［7］。

通過(guò)對(duì)綠原酸和蘆丁的含量測(cè)定，不同收集地、不同批次的綠原酸含量差異不大，而蘆丁的含量差異較大，可能與產(chǎn)地、貯藏、炮制工藝有關(guān)。相同收集地的不同批次樣品的綠原酸平均含量相比較，嶺南＞至信＞清平市場(chǎng)；而蘆丁平均含量相比較，至信＞嶺南＞清平市場(chǎng)，這可能與藥材采收季節(jié)、果實(shí)的成熟度不一致有關(guān)。

廣東王不留行是嶺南常用藥材，尚未收錄在《中華人民共和國(guó)藥典》，本實(shí)驗(yàn)建立了該藥材中蘆丁和綠原酸的含量測(cè)定方法，該方法快捷、準(zhǔn)確，可為完善廣東王不留行的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

表3 不同批次樣品中綠原酸、蘆丁的含量比較 （μg/ml）

表4 相同收集地的不同批次樣品中綠原酸、蘆丁的含量比較 （μg/ml）