克羅恩病患者血清miR-223表達(dá)與炎性反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后的關(guān)系

克羅恩病(CD)是一種慢性胃腸道炎性疾病，其病因尚未完全明確[1-2]。CD在歐美國家的發(fā)病率較高，在中國的發(fā)病率較低，但近年來其發(fā)病率呈升高趨勢[3]。CD的臨床表現(xiàn)多樣，包括腹痛、腹瀉、便血及腹部腫塊等，此外，部分患者可伴有發(fā)熱、貧血、營養(yǎng)不良、口腔潰瘍及關(guān)節(jié)腫痛等癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)生腸梗阻、穿孔或大出血[4-5]。因CD的臨床表現(xiàn)多樣，且易反復(fù)發(fā)作，所以需對(duì)CD患者的疾病活動(dòng)及預(yù)后進(jìn)行長期監(jiān)測?，F(xiàn)有的監(jiān)測CD疾病活動(dòng)的方法多屬于侵入性檢查，不僅耗時(shí)，而且費(fèi)用較高，并不適用于臨床常規(guī)檢查[6]。

微RNA(miRNA)是一類單鏈非編碼RNA，目前多數(shù)miRNA已被證實(shí)具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲等功能[7-8]。越來越多的研究表明，CD患者的外周血或組織的miRNA譜與健康人群存在差異[9-10]。本研究選取64例CD患者和53例同期健康體檢者分別作為CD組和對(duì)照組，比較兩組的血清miR-223相對(duì)表達(dá)量，并分析miR-223的相對(duì)表達(dá)量與CD炎性狀態(tài)及患者預(yù)后的關(guān)系，以期為CD的臨床診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年4月至2018年1月在青島市第八人民醫(yī)院被診斷為CD的89例患者作為研究對(duì)象，排除臨床資料不完整者7例，隨訪失聯(lián)者18例，最終納入64例患者作為CD組。根據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(2012年，廣州)》[11]對(duì)患者進(jìn)行診斷，并經(jīng)病理檢查證實(shí)為CD。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者臨床癥狀、體征及影像學(xué)表現(xiàn)均符合CD，并經(jīng)病理檢查證實(shí)；(2)隨訪期間患者病情進(jìn)展及治療等均符合CD自然病程；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并惡性腫瘤；(2)未簽署知情同意書；(3)隨訪失聯(lián)；(4)合并感染性疾病。本次研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

64例CD患者中，男性42例，女性22例，平均年齡(46.37±8.91)歲；病變部位包括回腸末端27例，結(jié)腸10例，回結(jié)腸27例；其中38例處于活動(dòng)期，26例處于緩解期；疾病行為無狹窄、無穿孔型55例，其中8例合并肛周病變，疾病行為狹窄型9例。另選擇53例同期健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性36例，女性17例，平均年齡(46.28±8.20)歲。兩組的性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 觀察指標(biāo)

收集并記錄受試者的年齡、性別、炎性反應(yīng)狀態(tài)、病變部位、疾病行為、C反應(yīng)蛋白(CRP)和紅細(xì)胞沉降率(ESR)水平、肛周病變情況等信息。根據(jù)CD患者的一般情況、腹痛、腹瀉及伴隨關(guān)節(jié)痛、虹膜炎、壞疽性膿皮病、新瘺管、膿腫等計(jì)算CD活動(dòng)指數(shù)(CDAI)[12]。根據(jù)CD患者內(nèi)鏡下潰瘍直徑大小、潰瘍面積百分比、炎性病變侵犯腸段面積百分比、腸管狹窄情況和受累腸段數(shù)目這5個(gè)方面計(jì)算CD簡化內(nèi)鏡評(píng)分(SES-CD)[13]。

1.3 血清miR-223表達(dá)量檢測

抽取受試者肘部靜脈血10 mL，3 500 r/min離心15 min，取上層清液于EP管中，-80℃環(huán)境下保存待驗(yàn)。應(yīng)用總RNA提取試劑盒(德國羅氏公司)提取血清中總RNA，同時(shí)檢測其吸光度值，若OD 260/280在1.8～2.0之間則進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取2 μg總RNA置于Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國羅氏公司)中合成cDNA，并將合成的cDNA置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性10 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt表示受試者血清中miR-223的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 預(yù)后隨訪及判斷

CD患者確診后，每個(gè)月通過電話或復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪，了解患者的病情及預(yù)后情況。隨訪截止時(shí)間為2019年1月31日。若CD患者在隨訪期間出現(xiàn)腹腔膿腫、腸瘺、腸梗阻、腸穿孔、消化道大出血及復(fù)雜性肛瘺等并發(fā)癥，或接受腸切除手術(shù)治療，亦或因CD死亡，均視為預(yù)后不良；反之，則視為預(yù)后良好[14-16]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組的血清miR-223相對(duì)表達(dá)量比較

CD組血清miR-223相對(duì)表達(dá)量為2.17±0.52，高于對(duì)照組(0.88±0.18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.341，P<0.001)。

2.2 不同炎性反應(yīng)狀態(tài)CD患者的血清miR-223相對(duì)表達(dá)量比較

CD組中炎性反應(yīng)狀態(tài)處于緩解期的患者的血清miR-223相對(duì)表達(dá)量為1.70±0.21，低于活動(dòng)期患者(2.49±0.40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.204，P<0.001)。

2.3 CD患者血清miR-223相對(duì)表達(dá)量與CDAI和SES-CD的關(guān)系

CD組患者的CDAI、SES-CD分別為6(3，7)分和9(2，13)分。CD組的血清miR-223相對(duì)表達(dá)量與CDAI及SES-CD均呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.725，P<0.001；rs=0.700，P<0.001)。見圖1。

2.4 影響CD患者預(yù)后的相關(guān)因素分析

隨訪結(jié)果顯示，64例CD患者中有27例(42.19%)預(yù)后不良。以血清miR-223相對(duì)表達(dá)量評(píng)價(jià)CD患者預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)(2.13)為界，將其轉(zhuǎn)換為二分類變量。通過比較預(yù)后不良組與預(yù)后良好組患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)兩組的年齡、性別、病變部位、CRP和ESR水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組的肛周病變、疾病行為和血清miR-223相對(duì)表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。將單因素分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)，包括肛周病變、疾病行為和血清miR-223相對(duì)表達(dá)量作為自變量，將預(yù)后是否良好作為因變量納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示存在肛周病變(OR=2.164，95%CI: 1.185～4.023，P=0.015)、疾病行為狹窄型(OR=5.026，95%CI: 3.018～7.095，P<0.001)和血清miR-223相對(duì)表達(dá)量>2.13(OR=4.173，95%CI: 2.305～8.124，P=0.022)的CD患者的預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高。

圖1 血清miR-223的相對(duì)表達(dá)量與CDAI及SES-CD的相關(guān)性分析 A CDAI B SES-CD

指標(biāo)預(yù)后不良組(n=27)預(yù)后良好組(n=37)χ2值P值年齡/歲0.1520.697 ≤4013(48.15)16(43.24) >4014(51.85)21(56.76)性別0.4660.495 男19(70.37)23(62.16) 女8(29.63)14(37.84)病變部位0.0990.952 回腸末端11(40.74)16(43.24) 結(jié)腸4(14.81)6(16.22) 回結(jié)腸12(44.44)15(40.54)CRP0.3700.543 升高21(77.78)31(83.78) 正常6(22.22)6(16.22)ESR0.1380.711 升高18(66.67)23(62.16) 正常9(33.33)14(37.84)肛周病變5.7200.017 有7(25.93)1(2.70) 無20(74.07)36(97.30)疾病行為3.8740.049 無狹窄、無穿孔型20(74.07)35(94.59) 狹窄型7(25.93)2(5.41)miR-223相對(duì)表達(dá)量5.1890.023 ≤2.139(33.33)23(62.16) >2.1318(66.67)14(37.84)

3 討論

目前用于監(jiān)測CD疾病活動(dòng)常用的生物標(biāo)志物有CRP和ESR，但兩者的特異度和敏感度均較低[17]。因miRNA不易被降解，且可參與多種疾病的調(diào)節(jié)，如腫瘤和炎性反應(yīng)等，故其可作為相應(yīng)疾病的生物標(biāo)志物[18]。Polytarchou等[19]的研究顯示miR-223在潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中高表達(dá)，但關(guān)于miR-223在CD患者外周血中表達(dá)情況的研究較少。腸鏡檢查是目前觀察CD患者炎性反應(yīng)狀態(tài)較為直觀的方法，取CD患者病變部位組織進(jìn)行檢查亦能評(píng)價(jià)其病理特征，但腸鏡檢查前CD患者需進(jìn)行腸道清潔，不僅給患者帶來不便，還增加了檢查時(shí)間。血清學(xué)檢測具有無創(chuàng)的特點(diǎn)，且操作簡單。本研究探討血清miR-223相對(duì)表達(dá)量對(duì)CD患者炎性反應(yīng)狀態(tài)和預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，以期為CD的臨床診治提供參考。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD組的血清miR-223相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，推測miR-223可能參與了CD的發(fā)生、發(fā)展過程。此外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，處于緩解期的CD患者血清miR-223相對(duì)表達(dá)量低于活動(dòng)期CD患者。CDAI是基于CD患者臨床癥狀、體征及相關(guān)并發(fā)癥進(jìn)行的評(píng)分，SES-CD是通過內(nèi)鏡觀察CD患者的潰瘍直徑大小、潰瘍面積百分比、炎性病變侵犯腸段面積百分比、腸管狹窄情況和受累腸段數(shù)目進(jìn)行的評(píng)分，可直觀評(píng)估病變部位的炎性反應(yīng)情況。CDAI和SES-CD均能在一定程度上評(píng)估CD患者的疾病活動(dòng)度。本研究結(jié)果顯示，CD患者血清miR-223相對(duì)表達(dá)量與CDAI及SES-CD均呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明miR-223與CD患者炎性反應(yīng)狀態(tài)關(guān)系密切，可能參與CD病情進(jìn)展，檢測CD患者血清miR-223相對(duì)表達(dá)量有助于了解CD患者的病情。

CD的預(yù)后是目前消化領(lǐng)域?qū)W者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，及早了解影響CD預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素有利于在CD診斷后盡早進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)，延緩病情進(jìn)展，甚至治愈CD。本研究隨訪了64例CD患者的預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)27例患者預(yù)后不良。通過單因素及Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示存在肛周病變、疾病行為狹窄型和血清miR-223相對(duì)表達(dá)量>2.13的CD患者的預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高，此結(jié)論與楊榮萍等[20]的報(bào)道基本一致。本研究因未考慮CD患者的發(fā)病年齡、診斷年齡等因素，因此今后還需補(bǔ)充研究影響CD患者預(yù)后的相關(guān)因素，并進(jìn)行大樣本、多中心研究，以彌補(bǔ)本研究的不足。

綜上所述，CD患者的血清miR-223相對(duì)表達(dá)量與其炎性反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后均有關(guān)。檢測CD患者血清miR-223相對(duì)表達(dá)量有助于了解其病情及預(yù)后，便于臨床醫(yī)師采取針對(duì)性治療。