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    肝纖維化過程中肝組織中Nrf2、NOX4 mRNA表達及血清ROS水平的變化

    2019-09-04 02:55:18
    國際消化病雜志 2019年4期
    關(guān)鍵詞:小葉氧化應(yīng)激纖維化

    肝纖維化是由各種急慢性肝損傷所引起的,由細胞外基質(zhì)(ECM)包括膠原蛋白、透明質(zhì)酸在肝組織間質(zhì)的合成和降解不平衡而導(dǎo)致的病理改變[1]。氧化應(yīng)激是影響肝纖維化進展的重要因素,其可促進肝纖維化形成,加重肝細胞壞死和凋亡[2]。氧化應(yīng)激是許多肝臟疾病的發(fā)病機制,在肝臟疾病的發(fā)展中起著重要作用[3]。近年來的研究表明,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)通過產(chǎn)生活性氧簇(ROS)等過氧化物來介導(dǎo)氧化應(yīng)激參與肝纖維化的進程,與肝纖維化密切相關(guān),而NOX家族成員之一的NOX4是ROS的主要來源,其在引起肝纖維化的主要細胞肝星狀細胞(HSC)中表達豐富,并通過介導(dǎo)多條細胞信號通路來誘導(dǎo)HSC活化,從而導(dǎo)致肝纖維化[4]。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是細胞抵御氧化應(yīng)激的重要的轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和下游基因表達,在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化中起保護作用[5]。本實驗采用CCl4誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型,觀察肝纖維化形成過程中肝組織中Nrf2 mRNA、NOX4 mRNA及血清ROS水平的變化,探討三者在肝纖維化形成過程中的作用,為臨床延緩和預(yù)防肝纖維化發(fā)生、發(fā)展提供新的診療依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料和主要試劑

    選取清潔健康的雄性大鼠30只,體重為190~210 g,購自河北醫(yī)科大學(xué)生理實驗室。血清ROS比色法試劑盒購自江蘇南京建成公司。Trizol裂解液、異丙醇、隨機引物、Buffer、dNTP、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、Nrf2、β-actin引物購自上海生工生物科技公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 動物模型制備及分組 將30只雄性SD大鼠隨機分為兩組,正常對照組6只,模型組24只。模型組大鼠每周2次給予40% CCl4油劑皮下注射,共8周,首次劑量為5 mL/kg,其后3 mL/kg。正常對照組給予相同劑量的食用油劑皮下注射。兩組大鼠均給予正常飲食。在第8周殺死正常對照組大鼠6只,在2、4、6、8周分別殺死模型組大鼠6只,留取相同部位的肝組織及血清備用。

    1.2.2 組織病理學(xué)檢查 10%甲醛溶液浸泡固定肝左葉組織,乙醇梯度脫水,二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ透明,浸蠟包埋,切成3 μm切片,常規(guī)HE及 Masson三色染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。根據(jù)膠原纖維增殖和肝臟結(jié)構(gòu)破壞程度,將肝纖維化分為S0~S4期:(1)S0期 無纖維化;(2)S1期 纖維化擴大但僅局限于小葉中央,未形成小葉間隔;(3)S2期 纖維化擴大,形成多條纖維間隔,但小葉結(jié)構(gòu)大致保留;S3期 大量纖維間隔形成并破壞肝小葉,導(dǎo)致小葉結(jié)構(gòu)紊亂,但無肝硬化;(4)S4期 早期肝硬化形成。

    1.2.3 血清ROS水平測定 采用比色法測定血清ROS水平。

    1.2.4 Real-time PCR測定肝組織中Nrf2、NOX4 mRNA水平 (1)采用TRizol試劑一步法抽提肝組織中總RNA,采用紫外線分光光度計測量RNA水平和純度;(2)取1 μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;(3)按照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10反應(yīng)體系進行Real-time PCR過程。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性10 min,隨后依次在94 ℃環(huán)境下15 s,60 ℃環(huán)境下60 s,共45個循環(huán),反應(yīng)結(jié)束。熒光定量PCR讀取每個目的基因與對照基因β-actin的CT值,并用Quantity One軟件進行相對定量統(tǒng)計分析,以2-ΔΔCT表示mRNA的相對表達量。Real-time PCR引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 病理學(xué)檢查結(jié)果

    光鏡下,正常對照組可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細胞索排列整齊,肝細胞無病變。在模型組早期階段,肝細胞水腫,氣球樣變及部分脂肪變;隨著造模時間延長,細胞脂肪變更加明顯,匯管區(qū)炎性反應(yīng)加重,并伴有不同程度的肝細胞壞死,肝小葉中央靜脈周圍及匯管區(qū)纖維沉積明顯增多;第8周時,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,形成假小葉。2周時模型組與正常對照組肝臟膠原纖維面積百分比的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而隨著造模時間的延長,與正常對照組相比,模型組的肝纖維化程度逐漸加重,肝臟膠原纖維面積百分比在4、6、8周時升高(6、8周時升高更明顯),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 兩組的肝纖維化病理分期和膠原纖維面積百分比比較()

    注:模型組(2周)與正常對照組比較,aP>0.05;模型組(4、6、8周)與正常對照組比較,bP<0.05

    2.2 兩組肝組織中Nrf2、NOX4 mRNA水平變化

    2、4、6、8周時模型組肝組織中Nrf2 mRNA、NOX4 mRNA水平均較正常對照組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但隨著肝纖維化的形成及加重,Nrf2 mRNA水平的升高幅度較NOX4 mRNA低,6、8周時尤為明顯。見表3、圖1。

    表3 兩組肝組織中Nrf2、NOX4mRNA水平比較()

    注:各時期模型組與正常對照組相比,aP<0.05

    2.3 兩組血清ROS水平變化

    隨著造模時間的延長,模型組肝纖維化逐漸形成和發(fā)展,血清ROS水平整體呈升高趨勢,6周時達到最高,8周時有所下降,且模型組2、4、6、8周時血清ROS水平均較正常對照組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

    圖1 兩組肝組織中Nrf2、NOX4 mRNA水平變化

    表4肝纖維化形成過程中血清ROS的變化

    組別數(shù)量/只ROS/μg·mL-1正常對照組61.56±0.84模型組2周61.84±0.69a模型組4周61.72±0.65a模型組6周62.48±1.14a模型組8周61.82±0.46a

    注:各時期模型組與正常對照組相比,aP<0.05

    2.4 相關(guān)性分析

    將Nrf2、NOX4與ROS進行Pearson相關(guān)分析,結(jié)果顯示Nrf2與ROS、Nrf2與NOX4、NOX4與ROS三組之間均存在正相關(guān)性(r=0.862,P=0.000;r=0.091,P=0.001;r=0.315;P=0.000)。

    3 討論

    肝纖維化是ECM過度沉積引起的慢性肝臟病理改變,是肝硬化和肝細胞癌發(fā)生的必經(jīng)途徑,其發(fā)生涉及各種機制,如局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活、基質(zhì)金屬蛋白酶表達失衡和自噬等。近年來的研究表明,NOX活化誘導(dǎo)的ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與肝纖維化形成密切相關(guān)。NOX家族主要由NOX1、NOX2、NOX3、NOX4等多種亞基組成,其中NOX4是纖維化發(fā)生過程中ROS的主要來源[6]。NOX4通過產(chǎn)生ROS,分別介導(dǎo)了血小板生成素、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等促纖維化因子作用下的細胞活化[7]。TGF-β是肝纖維化形成的重要調(diào)節(jié)因子,可通過TGF-β/Smad-3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)NOX4,介導(dǎo)HSC的活化,刺激膠原蛋白的合成和沉積。研究表明,NOX4的促纖維化反應(yīng)是由TGF-β介導(dǎo)的,它在TGF-β誘導(dǎo)的纖維化反應(yīng)中具有促進膠原產(chǎn)生等重要作用[8]。以往研究表明TGF-β激活HSC的過程依賴NOX的激活及ROS的產(chǎn)生,產(chǎn)生的ROS刺激PI3K/Akt途徑是肝纖維化形成的關(guān)鍵。此外,使用NOX4抑制劑GKT137831可有效減少CCl4或膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠ROS的產(chǎn)生和肝纖維化[9-10]。上述結(jié)果都說明NOX4激活產(chǎn)生ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與肝纖維化的形成密切相關(guān)。本實驗以CCl4誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型,發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的形成,肝組織中NOX4 mRNA及血清ROS水平呈升高趨勢,但8周時模型組血清ROS水平有所下降,這可能是由于隨著肝損傷的加重,機體無法清除大量的ROS,導(dǎo)致其明顯升高,而在肝纖維化后期,眾多促肝纖維化激活因子活化,使ROS的促纖維化作用弱化,表達水平下降。該結(jié)果表明ROS在肝纖維化形成中起著重要作用。研究表明阻斷PI3K活化可抑制HSC增殖和膠原蛋白沉積,從而抑制肝纖維化形成[8],這與本次實驗結(jié)果相符,也證實了ROS的促纖維化作用。進一步行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),NOX4 mRNA與ROS水平呈正相關(guān)。這一結(jié)論不僅證實了NOX4的促纖維化作用,而且其促纖維化作用可能是通過產(chǎn)生ROS來介導(dǎo)氧化應(yīng)激實現(xiàn)的。以往研究顯示氧化應(yīng)激可促進HSC激活以及增加膠原合成。

    Nrf2作為體內(nèi)抗氧化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,其與肝臟疾病的關(guān)系也日益受到重視[11-12]。生理狀態(tài)下Nrf2與其細胞質(zhì)錨連分子Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(KEAP1)結(jié)合而被泛素依賴性蛋白酶系統(tǒng)降解,僅殘留少部分用于維持還原型谷胱甘肽(GSH)等的基礎(chǔ)表達。氧化應(yīng)激時KEAP1發(fā)生磷酸化變構(gòu),與Nrf2解離。自由態(tài)的Nrf2進入細胞核,與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,Nrf2/ARE通路被激活后,啟動下游的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶,清除氧化應(yīng)激過程中過多的ROS,增強機體的抗氧化能力[13]。TGF-β是肝纖維化形成的關(guān)鍵因子,可通過Smad-3的激活而下調(diào)GST、GCLC、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的表達,而Nrf2能通過調(diào)節(jié)氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄激活蛋白和核因子-κB (NF-κB),下調(diào)TGF-β。GST、GCLC、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶均為Nrf2的下游基因,由此可見Nrf2與肝纖維的形成密切相關(guān)。因此,本研究以CCl4誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型,觀察肝纖維化形成過程中Nrf2的表達,發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進展,大鼠肝組織中Nrf2的表達呈升高趨勢,將Nrf2與NOX4的變化結(jié)合起來觀察,發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進展,兩者的表達均呈升高趨勢,并且相關(guān)性分析顯示兩者的表達呈正相關(guān),但Nrf2的表達升高幅度較NOX4低,在6、8周時尤為明顯,說明隨著肝纖維化的形成和發(fā)展,Nrf2無法拮抗NOX4,從而使其促進了肝纖維化的形成和發(fā)展,此結(jié)論不僅證實了NOX4的促纖維化效應(yīng)以及Nrf2的抗纖維化作用,也說明了NOX4、Nrf2在肝纖維化形成階段可能發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)給予Nrf2激活劑,可減慢由膽道結(jié)扎引起的小鼠肝纖維化的進展及降低促纖維化基因的表達。此外,與正常小鼠相比,Nrf2缺陷鼠對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷修復(fù)顯著延遲,肝纖維化程度及炎性反應(yīng)明顯加重,這是由于肝細胞的Nrf2及其編碼的酶減少,對CCl4及其代謝產(chǎn)物的解毒作用減弱有關(guān)[14]。這與本實驗結(jié)果相符,也證實了Nrf2的抗纖維化效應(yīng)。

    本研究通過觀察Nrf2、NOX4的表達與血清ROS水平的動態(tài)變化,證實了NOX4、ROS的促纖維化作用,以及Nrf2的抗纖維化作用。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)Nrf2、NOX4、ROS呈正相關(guān),說明可能存在NOX4通過產(chǎn)生ROS介導(dǎo)的促纖維化因子影響Nrf2表達。由此可見,Nrf2可能成為肝纖維化治療的一個新靶點。

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