化瘀壯骨湯對(duì)脛骨骨折模型大鼠骨痂中TGF1、bFGF及BMP-7表達(dá)的影響

張彥偉，李 兵

(濮陽惠民醫(yī)院 骨外科，河南 濮陽 457000)

骨愈合的過程受生物化學(xué)、血液循環(huán)狀態(tài)、人體微量因子及生物物理因子調(diào)控的影響、屬于一種有序、復(fù)雜的生物學(xué)修復(fù)過程[1]。研究表明[2]，10%的骨折由于各種因素的影響致使骨折無法愈合或愈合延緩，所以如何縮短骨折愈合時(shí)間，促進(jìn)骨折愈合非常重要。探討骨折愈合的機(jī)制能夠?yàn)榕R床治療提供可靠的理論依據(jù)，化瘀壯骨湯為本院醫(yī)師多年總結(jié)出的驗(yàn)方，有消腫止痛、活血化瘀的功效，是骨折治療的常用中藥制劑。本研究構(gòu)建SD大鼠脛骨骨折模型，以探討化瘀壯骨湯對(duì)其骨痂中相關(guān)生長(zhǎng)因子(TGF-β1、bFGF及BMP-7)表達(dá)的影響。

1 材料及方法

1.1 材料

雄性清潔級(jí)大鼠48只(購(gòu)自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，合格證：SCXK(滬)2013-0005。平均體質(zhì)量(275±25)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，普通飲食和喂水。

1.2 化瘀壯骨湯制備

化瘀壯骨湯成分：丹參100 g，骨碎補(bǔ)、續(xù)斷各150 g，炒胡瓜子、自然銅各100 g，土元90 g，水煎至100 mL濃縮液(劑量根據(jù)體質(zhì)量60 kg成人的10倍劑量[2])，并4℃下保存。

1.3 模型構(gòu)建

麻醉用戊巴比妥鈉(30 g/L)，根據(jù)40 mg/kg劑量腹腔注射。大鼠小腿內(nèi)側(cè)脫毛消毒，仰臥位固定，于脛骨骨干中部上1/3處皮膚做1.5 cm切口，暴露出脛骨骨干，用骨鋸鋸成橫行骨折，再用克氏針(規(guī)格：2 mm)向上(逆行)打入脛骨的上端，并穿出皮膚，將克氏針尾鉗斷，順行打進(jìn)脛骨干。最后活力碘沖洗，并在骨折的周圍滴入抗生素(慶大霉素)4滴，皮膚縫合后歸籠。正常飼養(yǎng)，并連續(xù)3天肌注青霉素6～8萬U，以預(yù)防感染。經(jīng)X線檢查顯示大鼠左股骨骨折，髓內(nèi)針固定在位，對(duì)位良好，表明造模成功[3]。48只大鼠均造模成功。

1.4 分組與干預(yù)

造模成功后將大鼠隨機(jī)分為兩組?；鰤压墙M自造模當(dāng)日麻醉蘇醒后給予化瘀壯骨湯100 mL分早晚2次灌胃，模型組給予等量的生理鹽水灌胃?；鰤压墙M及模型組均分別連續(xù)灌胃3天、1周、2周、4周。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均隨機(jī)處死大鼠6只。

1.5 蘇木精-伊紅染色

用尖刀將骨折端組織(1.0～1.5 cm)取下，并置于多聚甲醛40 g/L溶液中，4 ℃下固定48 h。脫鈣后梯度乙醇脫水，并進(jìn)行流水藍(lán)化、在脫水、分色及透明樹脂封固。最后置于顯微鏡下觀察。

1.6 TGF-β1、bFGF及BMP-7表達(dá)檢測(cè)

檢測(cè)用免疫組織化學(xué)法(SP)。檢測(cè)方法嚴(yán)格按照說明書中步驟進(jìn)行(二甲苯脫蠟、不同濃度乙醇水合、PBS漂洗、枸櫞酸鈉緩沖液加熱盒抗原修復(fù)、加一抗、加二抗、顯色復(fù)染、脫水封片，用Image-Pro Plus6.0軟件分別對(duì)TGF-β1、bFGF及BMP-7的平均光密度值進(jìn)行分析)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠骨折愈合及組織學(xué)變化情況

分析由蘇木精-伊紅染色可知，骨折1周時(shí)，有骨痂出現(xiàn)，主要有成熟及未成熟軟骨細(xì)胞，骨折處皮質(zhì)附近軟骨細(xì)胞表現(xiàn)肥大，局部有少量的新生骨小梁，周期有成骨細(xì)胞。化瘀接骨湯組的骨膜反應(yīng)比模型組明顯，骨痂2周時(shí)達(dá)最大，內(nèi)部有成骨細(xì)胞代替軟骨細(xì)胞，鏡下活血接骨組能見到少量新生編織骨。模型組主要表現(xiàn)為較成熟的軟骨細(xì)胞。在骨折4周時(shí)化瘀接骨組的新生編織骨有明顯增加，骨小梁明顯變粗，骨髓腔形成，能見到成熟的骨組織，骨痂(內(nèi)外)開始變薄。而模型組的骨小梁數(shù)目較化瘀接骨組少，且其間有少量軟骨細(xì)胞。見圖1。

注：A1、A2、A3分別為模型組1周、2周、4周時(shí)組織學(xué)變化；B1、B2、B3分別為化瘀壯骨組1周、2周、4周時(shí)組織學(xué)變化(HE×100)。

2.2 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1、bFGF及BMP-7表達(dá)

化瘀壯骨組骨折1周、2周、3周及4周時(shí)TGF-β1、bFGF及BMP-7表達(dá)與模型組比較，均有不同程度的升高(P<0.05)。骨折2周時(shí)化瘀壯骨組bFGF表達(dá)明顯高于模型組(t=3.929，P=0.003)；骨折3周時(shí)化瘀壯骨組TGF-β1、BMP-7表達(dá)明顯高于模型組(t=2.605、3.152，P=0.01、0.002)。見表1、圖2。

時(shí)間TGF-β1模型組化瘀壯骨組bFGF模型組化瘀壯骨組BMP-7模型組化瘀壯骨組骨折1周0.173±0.0260.191±0.0200.189±0.0170.212±0.0330.193±0.0430.196±0.050骨折2周0.161±0.0430.169±0.0170.207±0.0330.283±0.034a0.204±0.0290.246±0.059骨折3周0.139±0.0370.189±0.029a0.183±0.0270.185±0.0340.136±0.0210.193±0.039a骨折4周0.124±0.0280.141±0.0180.121±0.0200.131±0.0110.130±0.0150.150±0.016

注：與模型組比較，aP<0.05。

注：模型組A、化瘀壯骨組A為骨折3周時(shí)TGF-β1表達(dá)；模型組B、化瘀壯骨組B為骨折2周時(shí)bFGF表達(dá)；模型組C、化瘀壯骨組C為骨折3周時(shí)BMP-7表達(dá)。

圖2 兩組大鼠TGF-β1、bFGF及BMP-7表達(dá)情況(SP×200)

3 討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)中顯示，骨折主要的病機(jī)為瘀血阻滯，因此古代醫(yī)家多從“血”論治，有了“瘀未去則骨不接”“折傷專主血論”及“瘀去則新骨生”的說法[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究則表明[5]，骨折后的局部組織甚至全身血液往往在高凝狀態(tài)，骨組織的損傷使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，出現(xiàn)微循環(huán)障礙，使血液動(dòng)力受到影響，這些病理特征均與血瘀相關(guān)。因此，改善骨折機(jī)體的“血瘀”狀態(tài)，就能使骨組織灌注得到改善?；鰤压菧珵楸驹洪L(zhǎng)期實(shí)踐得出的治療骨折的驗(yàn)方，方中丹參為君藥，能去舊生新，活血化瘀，續(xù)斷、骨碎補(bǔ)則能補(bǔ)肝益腎，土元接筋續(xù)骨，破血散瘀，共為臣藥，炒甜瓜子止痛化瘀，自然銅接骨續(xù)筋，同為佐藥，諸藥合用，達(dá)到接骨續(xù)筋的目的?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)[6]，丹參還具有補(bǔ)益肝腎之功，使筋脈有滋養(yǎng)，骨化生有源，促進(jìn)骨折后受損組織瘀血吸收，為骨折新生創(chuàng)造良好環(huán)境。骨碎補(bǔ)能夠使蛋白多糖(促進(jìn)鈣化因子)合成增加，從而加速骨的生長(zhǎng)。自然銅主要成分之一為二氧化硫，其能夠增強(qiáng)骨的抗撕力，加速骨痂的形成[7]。有研究顯示[8]，土元提取物使血管新生加快，能夠促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)。本研究對(duì)骨折組織形態(tài)變化觀察發(fā)現(xiàn)，化瘀壯骨組大鼠新生骨數(shù)量與骨膜反應(yīng)改善比模型組明顯，由此證實(shí)化瘀壯骨湯具有接骨通絡(luò)之功。

TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族成員，廣泛在人體組織中存在，特別在骨組織中生物活性廣泛，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，參與組織的修復(fù)，誘發(fā)軟骨的形成等。有研究顯示，TGF-β1能夠誘導(dǎo)纖維連接蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)的形成。bFGF屬于一種骨代謝調(diào)節(jié)因子，在骨吸收及骨形成中起重要作用。BMP-7屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)家族中一員，是一類分子量較低的肽類物質(zhì)，在骨基質(zhì)中廣泛存在。BMP-7能夠促使骨間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨組織修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，化瘀壯骨組大鼠接受化瘀壯骨湯治療后，骨痂組織中TGF-β1、bFGF及BMP-7表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的升高，尤其在骨折愈合的2周或3周，兩組間表達(dá)有顯著性差異，由此提示，化瘀壯骨湯能夠使骨痂組織中TGF-β1、bFGF及BMP-7表達(dá)升高，從而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的目的。此結(jié)果與王希強(qiáng)等[10]的研究一致。

綜上所述，化瘀壯骨湯能夠促進(jìn)大鼠骨折愈合，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)骨痂組織中TGF-β1、bFGF及BMP-7表達(dá)有關(guān)。本研究也有不足之處，未能對(duì)大鼠血清中相關(guān)生長(zhǎng)因子水平進(jìn)行分析，這也是下一步研究的方向。