天麻破壁粉與凍干粉對小鼠急性肝腎毒性研究

劉春艷，盧禮平，田興中，柴藝匯，謝 宇，周 雯，牛建均，張麗艷*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽 550025；2.貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州貴陽 550018；3.張家口市第五醫(yī)院，河北張家口 075000；4.貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，貴州貴陽 550014)

天麻具有悠久的歷史，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并將其列為上品，具有熄風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，治療癲癇抽搐、肢體麻木、風(fēng)濕痹痛等病癥[1]，主產(chǎn)于貴州、云南、四川及華北地區(qū)[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，天麻具有神經(jīng)保護(hù)、抗驚厥、降血壓、增強免疫力等多種作用[3]。天麻化學(xué)成分復(fù)雜，其主要成分為天麻素、天麻苷元，此外還含有多種氨基酸及微量元素等[4]。歷代本草均認(rèn)為天麻無毒，現(xiàn)代臨床應(yīng)用天麻飲片亦未見毒性報道。另外，天麻還被視為“藥食兩用”的名貴中藥保健產(chǎn)品被廣泛食用。中藥破壁粉和凍干粉是為改善傳統(tǒng)中藥飲片使用方式，采用先進(jìn)工藝制成的新型中藥劑型。中藥破壁粉是通過現(xiàn)代粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)中藥飲片加工至D90<45 μm的粉體[5]，天麻凍干粉是通過低溫條件下水的升華性能，使傳統(tǒng)飲片在真空環(huán)境低溫脫水形成的干燥粉劑。二者在不改變傳統(tǒng)中藥飲片的物質(zhì)基礎(chǔ)上，實現(xiàn)中藥品質(zhì)的均勻性及確保中藥的安全性，也提高了中藥材的利用率[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，天麻破壁飲片工藝有助于提高其溶出效率[7]。其冷凍干燥技術(shù)可更好地保持藥材品質(zhì)，同時使天麻有效成分避免因受熱干燥造成的分解和散失[8-10]。目前，尚未出現(xiàn)專門針對天麻破壁飲片、凍干粉毒副作用、毒性物質(zhì)基礎(chǔ)和產(chǎn)生毒副作用的劑量范圍的相關(guān)研究。本實驗以小鼠為研究對象，觀察24 h內(nèi)多次給予小鼠不同劑量天麻破壁飲片或凍干粉，觀察其對小鼠日常行為及肝、腎功能的影響，并與抗癲癇治療中的一線藥物丙戊酸鈉毒性反應(yīng)進(jìn)行比較[11]，為天麻破壁粉和凍干粉在醫(yī)藥、保健方面的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物

SPF級昆明種健康小鼠100只，體重18～22 g，雌雄各半，動物許可證號：SCXK(軍)2012-0011，購于慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司。

1.2 試劑

丙戊酸鈉(賽諾菲安萬特(杭州)制藥有限公司，批號：6HG0478)；生理鹽水；多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20180112)；PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9062)；無水乙醇(江蘇海興化工有限公司，批號：GB678-90)，二甲苯(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：20180110)；蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：BA-4097)；伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號BA-4099)，中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20171009)。

1.3 儀器

TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)。

1.4 藥物

本品來源于貴州大方，藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物栽培教研室魏升華教授鑒定為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl．的干燥塊莖。破壁粉：60 ℃烘干，經(jīng)破壁粉碎加工、干壓制粒而成；凍干粉：新鮮天麻切制，滅菌，再用真空干燥機凍干，過藥典小鋼磨粉碎后過6號篩。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

將100只昆明小鼠隨機分為10組，雌雄各半，分別為正常組給予等量生理鹽水，丙戊酸鈉低、中、高劑量組(0.3 g/kg、0.6 g/kg、0.9 g/kg)，天麻(破壁飲片、凍干粉)低、中、高劑量組(15 g/kg、30 g/kg、45 g/kg)。給藥組天麻破壁飲片、天麻凍干粉，加適量蒸餾水研磨均勻，分別配制成剛好通過16號灌胃針的混懸液最大濃度，再根據(jù)各劑量組所需給藥劑量稀釋成所需濃度，各組1日之內(nèi)灌胃給藥3次，灌胃溶積為0.2 mL/10 g動物體重(小鼠灌胃最大容積)，間隔時間為6 h。給藥后即刻開始觀察藥物的毒理反應(yīng)情況，給供試品當(dāng)天連續(xù)觀察18 h，記錄3次。以后每天觀察記錄2次，連續(xù)觀察14天。

2.2 觀察動物一般體征

觀察動物的活動、毛發(fā)、分泌物、大小便等一般體征，觀察急性毒性試驗動物反應(yīng)性指標(biāo)。若有動物死亡，記錄死亡數(shù)目和死亡時間，詳細(xì)記錄每只動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的癥狀及癥狀開始、消失的時間。

2.3 血清生化指標(biāo)檢測

斷頭采集小鼠血液，以2 500 rpm/min，4 ℃離心15 min后吸取血清，全自動生化儀檢測小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)含量。

2.4 小鼠肝臟及腎臟病理檢測

取小鼠新鮮肝腎組織適當(dāng)大小迅速放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片，HE染色，采用麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于40倍下觀察全部肝臟組織，觀察大體病變，選擇要觀察的區(qū)域采集400倍圖片，觀察具體病變。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 小鼠體重變化及一般情況

與正常組比較，天麻破壁粉與凍干粉各劑量組小鼠體重在第1天、第7天、第14天比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。小鼠一般體征變化以丙戊酸鈉各劑量組較為多發(fā)，以神經(jīng)系統(tǒng)方面反應(yīng)為主。第1、2、3次給藥后丙戊酸鈉、天麻破壁粉及凍干粉各劑量組小鼠均以安靜為主要表現(xiàn)，考慮為丙戊酸鈉和天麻正常藥理反應(yīng)，非毒性反應(yīng)。丙戊酸鈉0.3 g/kg組第2次給藥后個別小鼠出現(xiàn)興奮現(xiàn)象，丙戊酸鈉0.6 g/kg組第2次給藥后個別小鼠出現(xiàn)震顫，丙戊酸鈉0.9 g/kg組第2次給藥后多只小鼠出現(xiàn)不安、異常叫聲，持續(xù)時間均較短；天麻破壁粉及凍干粉高劑量組個別小鼠在給藥過程中出現(xiàn)異常叫聲、震顫、運動失調(diào)現(xiàn)象，持續(xù)時間均較短。各給藥組在給藥后第2～14天均未出現(xiàn)異常體征。

組別劑量(g·kg-1)第1天第7天第14天Control-26.23±3.3832.56±3.5636.66±3.75VPA-0.30.326.45±3.1531.69±3.8334.16±3.16VPA-0.60.628.06±3.1631.95±3.4936.22±3.50VPA-0.90.927.76±4.3632.53±4.2234.95±5.01PB-151526.30±4.1133.63±3.9834.44±3.85PB-303026.00±3.1632.72±3.2035.75±2.83PB-454527.19±3.8233.04±3.9138.25±5.40DG-151526.81±4.0532.50±4.1234.59±2.54DG-303027.32±4.4031.89±3.9134.83±3.61DG-454527.17±4.5532.67±2.9836.41±3.80

注：Control：正常組；VPA-0.3：丙戊酸鈉低劑量組；VPA-0.6：丙戊酸鈉中劑量組；VPA-0.9：丙戊酸鈉高劑量組；PB-15：天麻破壁粉低劑量組；PB-30：天麻破壁粉中劑量組；PB-45：天麻破壁粉高劑量組；DG-15：天麻凍干粉低劑量組；DG-30：天麻凍干粉中劑量組；DG-45：天麻凍干粉高劑量組。

3.2 小鼠血清ALT、AST、AKP含量檢測結(jié)果

與正常組比較，丙戊酸鈉0.6、0.9 g·kg-1組小鼠血清ALT含量顯著升高(P<0.05)，天麻破壁粉與凍干粉各劑量組及丙戊酸鈉0.3 g·kg-1組小鼠血清ALT含量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均顯著低于丙戊酸鈉0.9 g·kg-1組；與正常組及丙戊酸鈉各劑量組比較，天麻破壁粉與凍干粉各劑量組小鼠肝功能檢測指標(biāo)AKP、AST血清含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：與Control比較,1)P<0.05；與VPA-0.3組比較,2)P<0.05；與VPA-0.6組比較,3)P<0.05；與VPA-0.9組比較,4)P<0.05。

3.3 小鼠血清MCP-1、BUN、Cr、UA含量檢測結(jié)果

與正常組比較，丙戊酸鈉0.6 g·kg-1、0.9 g·kg-1組小鼠血清MCP-1、Cr含量顯著升高(P<0.05)，天麻破壁粉與凍干粉各劑量組及丙戊酸鈉0.3 g·kg-1組小鼠血清ALT含量與正常組比較無顯著差異，均顯著低于丙戊酸鈉0.6、0.9 g·kg-1組；與正常組及丙戊酸鈉各劑量組比較，天麻破壁粉與凍干粉各劑量組小鼠腎功能檢測指標(biāo)BUN、UA血清含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別劑量(g·kg-1)MCP-1(ng·L-1)Control-30.45±5.50VPA-0.30.331.00±6.99VPA-0.60.647.32±11.141)2)VPA-0.90.964.23±10.551)2)3)PB-151533.16±4.323)4)PB-303032.96±5.233)4)PB-454538.11±7.081)3)4)DG-151528.84±9.033)4)DG-303034.26±8.713)4)DG-454539.99±8.971)2)3)4)

注：與Control比較,1)P<0.05；與VPA-0.3組比較,2)P<0.05；與VPA-0.6組比較,3)P<0.05；與VPA-0.9組比較,4)P<0.05。

組別劑量(g·kg-1)Ccr(μmol·L-1)BUN(mmol·L-1)UA(μmol·L-1)Control-11.34±5.956.29±1.4993.50±22.95VPA-0.30.315.41±2.431)6.09±1.4994.50±30.93VPA-0.60.626.36±6.381)2)5.89±1.25106.50±29.98VPA-0.90.927.50±4.501)2)6.88±1.02111.50±32.90PB-151512.93±2.623)4)6.49±0.81115.50±38.38PB-30308.62±2.372)3)4)6.80±1.61101.50±34.71PB-454512.64±2.323)4)6.76±0.93103.50±32.21DG-151512.30±3.153)4)6.80±1.13105.50±34.58DG-303011.51±2.633)4)6.81±1.03108.50±36.04DG-454512.30±4.213)4)6.03±1.07101.50±37.99

注：與Control比較,1)P<0.05；與VPA-0.3組比較,2)P<0.05；與VPA-0.6組比較,3)P<0.05；與VPA-0.9組比較,4)P<0.05。

3.4 小鼠肝組織病理檢測結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，正常組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞分葉不明顯，肝細(xì)胞形態(tài)正常，未見纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤等病理變化。丙戊酸鈉低劑量組部分樣本可見肝細(xì)胞少量點狀壞死，丙戊酸鈉中劑量組部分樣本可見肝細(xì)胞點狀或灶狀壞死，肝細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤較丙戊酸鈉中劑量組重；天麻破壁中劑量組部分樣本出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，可見肝細(xì)胞呈輕微的點狀或小灶狀肝細(xì)胞壞死；天麻破壁粉及凍干粉高劑量組肝細(xì)胞出現(xiàn)點狀或小灶狀肝細(xì)胞壞死并伴有輕微炎細(xì)胞浸潤，以天麻破壁粉高劑量組相對較重。天麻破壁低劑量組及凍干粉低、中劑量組與正常組比較無顯著差異。在光鏡觀察下，本實驗部分動物肝臟組織可見少量肝細(xì)胞空泡變性，可能與動物解剖前禁食不完全致使肝細(xì)胞內(nèi)肝糖原過多所致，也可能與缺氧等環(huán)境因素有關(guān)，多考慮為自發(fā)性病變，與受試藥物無關(guān)。見圖1。

3.5 小鼠腎組織病理檢測結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，正常組腎臟被膜完整，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰，皮質(zhì)內(nèi)腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、腎曲小管、髓袢及集合小管內(nèi)均未見明顯病理變化。丙戊酸鈉低劑量組部分樣本可見輕度腎小球變性及腎小管上皮細(xì)胞變性或脫落，丙戊酸鈉中劑量組部分樣本可見輕度腎小球腫大，可見腎小管上皮細(xì)胞不同程度腫脹變性，呈“氣球”樣，部分組織可見腎小管管腔擴(kuò)張，其內(nèi)可見均質(zhì)紅染的透明管型；丙戊酸鈉高劑量組部分樣本可見皮質(zhì)內(nèi)腎小球萎縮，中央血管球體積縮小，腎小囊腔增大，部分組織可見腎小球不同程度的腫大，腎小囊腔幾乎不可見，均可見腎小管上皮細(xì)胞不同程度腫脹變性，部分變性細(xì)胞脫落于管腔中，偶見細(xì)胞核濃縮變??；天麻破壁粉中、高劑量組及天麻凍干粉高劑量組部分樣本均可見腎小管上皮細(xì)胞變性或脫落，腎小管上皮細(xì)胞不同程度腫脹變性，部分變性細(xì)胞脫落于管腔中，偶見細(xì)胞壞死，細(xì)胞核固縮；天麻破壁粉高劑量組還可見部分樣本腎小球腫大。天麻破壁低劑量組及凍干低、中劑量組與正常組比較未見顯著差異。在光鏡觀察下，本試驗部分動物腎臟組織均可偶見少量腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，可能是由于組織固定及制片過程中造成的人工假象，或是由環(huán)境中缺氧等因素引起，多考慮與受試藥物無關(guān)。見圖2。

圖1 天麻破壁粉、凍干粉、丙戊酸鈉各劑量組小鼠肝組織病理檢測(HE染色)結(jié)果(×400)

圖2 天麻破壁粉、凍干粉、丙戊酸鈉各劑量組小鼠腎組織病理檢測(HE染色)結(jié)果(×400)

4 討論

《本草綱目》云：“天麻，為治風(fēng)之神藥。”天麻乃肝經(jīng)氣分之藥，貴州天麻素有“北參黔麻”的美譽，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為天麻具有抗驚厥、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等藥理作用，且在治療驚厥方面療效顯著[12]。中藥藥效不只由藥物特有的化學(xué)成分所決定，還可能與藥物的物理化學(xué)狀態(tài)等因素密切相關(guān)，中藥中天麻尚未見中毒或致死報道。

根據(jù)2014年《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，急性毒性是指“藥物在單次或24 h內(nèi)多次給予后一定時間內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)”[13]，本實驗依據(jù)小鼠最大單次給藥容積和濃度進(jìn)行計算，24 h內(nèi)給予天麻破壁粉、凍干粉3次，天麻破壁粉(PB)和凍干粉(DG)低、中、高劑量組最終給藥劑量分別為15 g/kg、30 g/kg、45 g/kg，分別為天麻臨床等效用量的10倍、20倍、30倍；丙戊酸鈉用量為天麻用量的1/50,分別為0.3 g/kg、0.6 g/kg、0.9 g/kg，分別為丙戊酸鈉臨床等效用量的1倍、2倍、3倍。觀察時間為14天，就肝腎功能血清指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)含量，一般情況及肝腎HE染色組織病理改變，探討其對小鼠肝、腎組織的急性毒性反應(yīng)。結(jié)果顯示，10倍天麻臨床等效劑量的破壁粉與20倍天麻臨床等效劑量的凍干粉低劑量組小鼠血清ALT、AST、AKP、MCP-1、BUN、Cr、UA水平，體重及肝腎組織病理改變與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，20及30倍天麻臨床等效劑量的破壁粉中、高劑量組及30倍天麻臨床等效劑量的凍干粉高劑量組小鼠肝腎組織病理改變與正常組比較有顯著性差異，且天麻破壁粉與凍干粉高劑量組小鼠血清MCP-1水平顯著高于正常組(P<0.05)，表明天麻破壁粉與凍干粉出現(xiàn)毒副反應(yīng)的劑量遠(yuǎn)高于臨床正常應(yīng)用量。本研究部分填補了天麻破壁粉與凍干粉藥理毒理研究，為其在臨床及保健方面的推廣運用提供了一定的實驗依據(jù)。