HMGB1在哮喘大鼠氣道炎癥中的作用及苗藥熱咳喘膠囊干預(yù)效果

張永平，吳琴琴，徐 麗，李 琴，余慧娟

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003)

支氣管哮喘(Bronchial Asthma)是一種由T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥性疾病。氣道炎癥是其最為重要的病理特征之一，是目前公認(rèn)的支氣管哮喘發(fā)病的重要因素。HMGB1是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的具有顯著促炎作用的炎癥因子，與多種炎癥性疾病的病理生理過程息息相關(guān)。有臨床研究報(bào)道，在哮喘患者的痰和血漿中HMGB1的水平明顯增加，且痰中HMGB1的表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)呈明顯的負(fù)相關(guān)，這提示HMGB1可能參與了哮喘氣道慢性炎癥反應(yīng)的過程[1]。苗藥熱咳喘膠囊由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院治療哮喘經(jīng)驗(yàn)方所制成，經(jīng)長(zhǎng)期臨床運(yùn)用，療效顯著。本研究通過觀察哮喘大鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU的計(jì)數(shù)及HMGB1含量，以了解HMGB1與哮喘氣道炎癥的相關(guān)性及苗藥熱咳喘膠囊對(duì)HMGB1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康清潔級(jí)SD大鼠40只，體重 120～140 g，月齡6～9個(gè)月，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室采光、通風(fēng)良好，室溫(22±2) ℃，濕度為 60%～70%，自由進(jìn)食、飲水，自由活動(dòng)，分籠飼養(yǎng)，正常飼養(yǎng)5天后，觀察各籠大鼠無異常表現(xiàn)。

1.1.2 藥物及試劑 苗藥熱咳喘膠囊由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科制備：全瓜蔞(真花休)15 g、法夏(科辣)12 g、黃芩(額嘎)15 g、百部(窩嘎單里、銳敗呆)15 g、炙僵蠶(崗阿大) 15 g、地龍9 g、青黛6 g、蛤粉6 g、橘紅12 g、炒葶藶子12 g、杏仁10 g、桑白皮12 g、紫苑15 g、天竺子10 g、麻黃10 g、炙甘草10 g，上方醇提制成膠囊劑，每粒含生藥2.76 g。0.9%氯化鈉注射液500 mL(貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：A14122812-2)，醋酸地塞米松注射液5 mg(貴州光正制藥有限責(zé)任公司，批：140828)，OVA(美國Sigma公司)，Al(OH)3(上海分工生產(chǎn))，滅活百日咳桿菌疫苗(北京生物制品研究所)，磷酸緩沖液(PBS)北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，大鼠HMGB1 ELISA試劑盒96T(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，兩用型水箱(BDS北京醫(yī)療器械設(shè)備廠)，自制塑料霧化箱30 cm×30 cm×45 cm，電熱恒溫水箱(HHW21420型湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)，手術(shù)中所用的器械(止血鉗、鑷子、眼科剪等貴州中醫(yī)藥大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)室)，醫(yī)用超聲霧化器貝爾斯BSW-2A(河北貝爾斯科技有限公司)，普通冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)，電子天平(JY2001上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司)，-4 ℃低溫冰箱(Thermo Scientific公司)。

1.1.4 動(dòng)物分組 40只雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組，每組各10只。

1.2 研究方法

1.2.1 哮喘模型建立 除正常對(duì)照組外，參照呂國平等人[2]的方法，并加以改進(jìn)進(jìn)行造模。實(shí)驗(yàn)第1天，大鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水抗原液(內(nèi)含卵蛋白OVA100 mg，氫氧化鋁(Al(OH)3)100 mg，滅活百日咳菌苗5×109個(gè))1 mL進(jìn)行致敏，第8天重復(fù)上述操作。第15天腹腔注射后將大鼠放到霧化箱中，采用濃度為5% OVA溶液15 mL以超聲霧化吸入的方式激發(fā)大鼠哮喘發(fā)作，每天激發(fā)1次，每次持續(xù)時(shí)間為30 min，共激發(fā)7天。大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸急促、煩躁不安、弓背、抽搐或者跌倒等癥狀，說明哮喘模型激發(fā)成功。

1.2.2 給藥方法 正常組：第1天、第8天、第15天腹腔注射生理鹽水1 mL，第15天開始每次激發(fā)前1 h予生理鹽水3 mL灌胃，連續(xù)7天；模型組：第15天開始每次激發(fā)前1 h予生理鹽水3 mL灌胃，連續(xù)7天；地塞米松組：第15天起開始每次激發(fā)前1 h予醋酸地塞米松注射液50 μg/mL 3 mL(根據(jù)人鼠使用劑量換算，按1 mg/kg/d)腹腔注射，療程為2周；苗藥熱咳喘膠囊組：按照人鼠用藥劑量換算，第15天起每次激發(fā)前1h予熱咳喘膠囊2.10 g/kg，予熱咳喘膠囊粉配制后灌胃，3 mL/只/次，療程為2周。

1.2.3 BALF的提取 每組大鼠在療程結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛以0.35 mL/100 g進(jìn)行麻醉，麻醉好后，將大鼠仰臥固定于固定架上，股動(dòng)脈放血處死，酒精消毒頸部及胸部，在超凈工作臺(tái)內(nèi)以無菌器械打開胸腔，完整分離心肺，分離氣管及左、右主支氣管，并結(jié)扎右側(cè)主支氣管。在氣管的第二、三軟骨環(huán)間做一個(gè)橫行切口，置入連接注射器的硅膠管，然后用“0”號(hào)手術(shù)線結(jié)扎固定，用一次性注射器將2.5 mL生理鹽水緩慢注入氣管和左側(cè)肺當(dāng)中，氣管插管約0.5 cm，停留約30 s后緩慢抽回，以上動(dòng)作重復(fù)操作5次，最后將5次抽取的BALF混合(回收率在85%以上為合格)。在4 ℃低溫下10 000 rpm離心5 min，取上清液后放至-4 ℃冰箱保存。

1.2.4 BALF中EOS及NEN計(jì)數(shù) 將正常組及模型組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞沉淀從-4 ℃冰箱取出，先用磷酸緩沖液(PBS)重懸BALF細(xì)胞懸液，然后取出來50 μL進(jìn)行涂片，在涂片干燥以后再進(jìn)行瑞氏(Wright-stain)染色，然后計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞作分類計(jì)數(shù)，至少進(jìn)行4個(gè)視野的計(jì)數(shù)(在光學(xué)顯微鏡下)，將細(xì)胞分為EOS、NEU、淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞(依據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn))，最后計(jì)算BALF中EOS及NEU數(shù)量。

1.2.5 BALF中HMGB1含量的測(cè)定 正常組、模型組、苗藥熱咳喘膠囊組及地塞米松組均根據(jù)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行操作，依據(jù)吸光度OD值計(jì)算出BALF標(biāo)本中HMGB1的含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果是多組正態(tài)資料的均數(shù)比較選方差分析，如果是兩兩多重比較選LSD法。

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液中EOS、NEU計(jì)數(shù)及HMGB1含量

正常組與模型組肺泡灌洗液中EOS、NEU計(jì)數(shù)及HMGB1含量比較，正常組均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

組別nEOS(×109/L)NEN(×109/L )HMGB1(μg/L)正常組100.09±0.0091.20±0.4223.726±1.320模型組100.29±0.023▲6.40±1.838▲14.658±0.843▲

注：與正常組比較，▲P<0.05。

2.2 肺泡灌洗液中HMGB1含量

與正常組比較，模型組、苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組BALF中HMGB1含量明顯高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與苗藥熱咳喘膠囊組比較，地塞米松組低于苗藥熱咳喘膠囊組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 BALF中HMGB1含量結(jié)果從高到低依次為：模型組、苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組、正常組。見表2。

組別nHMGB1含量正常組模型組苗藥熱咳喘組地塞米松組101010103.726±1.32014.658±0.843▲5.895±0.929▲●5.459±0.842▲●Δ

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較，●P<0.05；與苗藥熱咳喘膠囊組比較，ΔP>0.05。

3 討論

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥性疾病，伴有氣道高反應(yīng)性、氣道阻塞和氣道重塑[3]。其基本特征是氣道高反應(yīng)性炎癥、微血管滲漏、黏液分泌增加和平滑肌收縮所導(dǎo)致的可逆性氣道阻塞及氣道高反應(yīng)性。氣道的慢性炎癥反應(yīng)促使氣道結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致氣道重塑使哮喘癥狀發(fā)生及進(jìn)一步發(fā)展[4]。而氣道慢性炎癥以EOS浸潤(rùn)為主，EOS是支氣管哮喘氣道炎癥中十分關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，EOS能夠在氣道中聚集并活化進(jìn)而引起哮喘的發(fā)病。而HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)，近年來研究顯示HMGB1可能參與多個(gè)呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理過程，在哮喘等慢性炎癥氣道疾病的地位也越來越受到人們的重視[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，HMGB1可以使EOS活化，并能夠提高EOS的存活時(shí)間[6]。有臨床研究報(bào)道，在哮喘患者的痰和血漿中HMGB1的水平明顯增加，且痰中HMGB1的表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)呈明顯的負(fù)相關(guān)，這提示HMGB1可能參與了哮喘氣道慢性炎癥反應(yīng)的過程[1]。

苗藥熱咳喘膠囊是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院治療支氣管哮喘的經(jīng)驗(yàn)方，多年來臨床實(shí)踐證實(shí)對(duì)治療哮病熱哮證有顯著療效。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，方中瓜蔞提取物中天門冬氨酸能增強(qiáng)細(xì)胞免疫活性，減輕炎癥反應(yīng)，減少痰液的分泌，半胱氨酸能裂解痰液黏蛋白，使痰液變稀促進(jìn)痰液排出[7]。麻黃中含有較多麻黃堿，偽麻黃堿能緩解支氣管平滑肌痙攣[8]。地龍富含氨基酸及多種礦物質(zhì)和微量元素，能顯著增強(qiáng)細(xì)胞表面Fc受體的功能，可以阻止EOS激活[9]。桑白皮在呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)為抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的作用[10]?？嘈尤手兴目嘈尤受辗纸獬鰜淼臍淝杷崮軌蚴购粑由?，使咳嗽減輕[11]。葶藶子內(nèi)的芐基芥子油具有抗菌作用，能夠緩解平滑肌痙攣[12]。半夏所含β-谷甾醇具有止咳、抗癌、抗炎及降低血液中膽固醇的作用，可以減少支氣管分泌物從而起到鎮(zhèn)咳祛痰的作用[13]。黃芩能不同程度抑制細(xì)菌和病毒，也能夠提高機(jī)體的殺菌力[14]。黃芩、百部共用能夠使黃芩總黃酮和黃芩苷的含量增多，進(jìn)而增強(qiáng)清熱、抗炎的作用。蛤粉富含豐富的氨基酸和多種微量元素，如谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸及鈣、鋅、鐵等，且蛤蚧身和尾的醇提取物具有明顯抗炎、解痙、平喘作用。橘紅中的橘紅多糖可以止咳化痰。百部主要成分為百部堿，有中樞性鎮(zhèn)咳的作用，其作用強(qiáng)度與氨茶堿類似，緩慢而持久?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草具有抗炎、抗氧化、抗病毒、治療多種呼吸系統(tǒng)疾病、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強(qiáng)免疫功能等功能，還能保護(hù)發(fā)炎的咽喉和氣管黏膜。

本研究結(jié)果表明，模型組肺泡灌洗液中EOS、NEU計(jì)數(shù)及HMGB1含量均明顯高于正常組，苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組肺泡灌洗液中HMGB1含量明顯低于模型組，以上說明HMGB1與哮喘發(fā)生相關(guān)，其可能參與了哮喘氣道炎癥的形成，苗藥熱咳喘膠囊和地塞米松均能抑制哮喘大鼠氣道中HMGB1的表達(dá)。由于時(shí)間和大鼠樣本量有限，故本研究結(jié)果仍需大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究加以證實(shí)。