基于前表面熒光光譜技術(shù)的隱性孔雀石綠快速檢測(cè)方法

阮媚，黃海峰，王宇，謝泓，陳秀珊，劉鳳銀，穆洪濤＊

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510303；2.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

孔雀石綠（Malachite green，MG）對(duì)人類細(xì)胞具有致突變性、致癌性，屬于第二類致癌物，會(huì)對(duì)人類的身體健康造成極大的影響?？兹甘G在環(huán)境中能代謝為脂溶性的隱性孔雀石綠（Leuco malachite Green，LMG），能長(zhǎng)期殘留在水產(chǎn)品中具有高殘留及高毒性，對(duì)人體造成更大的危害，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。我國(guó)于2002年頒布《無(wú)公害食品標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》（NY 5070-2002），明確指出孔雀石綠在水產(chǎn)品中不得檢出[1]。國(guó)家已明令禁止，但因保證水產(chǎn)品在市場(chǎng)上的鮮活度，其使用仍舊非常普遍。目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道檢測(cè)水產(chǎn)品中的MG和LMG的方法有高效液相色譜法[2]、分光光度法[3]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法[4]、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[5]和表面增強(qiáng)拉曼光譜法[6]等。但實(shí)際檢測(cè)中主要采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法，如 GB/T 19857-2005、SN/T 1479-2004 和SC/T 3021-2003。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法具有高靈敏度、高準(zhǔn)確率等特點(diǎn)，但其前處理操作步驟復(fù)雜繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且需要較昂貴的分析儀器，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)技術(shù)的要求較高，難以對(duì)大批量水產(chǎn)品進(jìn)行分析，不適于普查。

圖1 隱性孔雀石綠（LMG）的結(jié)構(gòu)

前表面熒光技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用食品化學(xué)和生物科學(xué)領(lǐng)域中固體和非透明液體等樣品的熒光數(shù)據(jù)的檢測(cè)方法，其高靈敏性、特異性和無(wú)損的特點(diǎn)在食品化學(xué)研究中起著極其重要的作用[7]。前表面熒光在食品化學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)應(yīng)用于紅酒鑒定、紅酒中多酚的定量、牛乳的變化、鱈魚魚片儲(chǔ)存過(guò)程中的變化和橙汁等方面。LMG具有熒光特征，且具有較明顯的熒光特征峰。應(yīng)用前表面熒光技術(shù)可對(duì)水產(chǎn)品中LMG殘留進(jìn)行快速無(wú)損檢測(cè)建立新的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

RF-5301PC島津熒光分光光度計(jì)：購(gòu)自杭州英斯特科技有限公司；FA1004B電子分析天平（0.1 mg）：購(gòu)自上海平軒科學(xué)儀器有限公司；賽洛捷克Scilogex MX-F 旋渦混合器：購(gòu)自上海偉進(jìn)生物科技有限公司。

隱性孔雀石綠（源葉生物科技有限公司），乙腈（北京伊諾凱科技有限公司），苯、甲苯、石油醚（廣州化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

選取乙腈作為隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液配制的溶劑，準(zhǔn)確稱取0.0040 g隱性孔雀石綠顆粒于離心管中并用錫箔紙緊密包裹，防止隱性孔雀石綠光解為其他物質(zhì)[8]；將隱性孔雀石綠溶于4 mL乙腈溶液中，得到1 mg/mL的隱性孔雀石綠乙腈儲(chǔ)備液，再用該溶液稀釋配制成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90μg/L 和 100 μg/L的隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液，待用。

1.2.2 最佳波長(zhǎng)的確定

采集100 μg/L的隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液的最佳激發(fā)波長(zhǎng)（Excitation，EX）和發(fā)射波長(zhǎng)（Emission，EM）。光譜掃描范圍：激發(fā)波長(zhǎng)范圍為220～420 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為220～620 nm，狹縫寬度為λex=5nm，λem=5nm，使用四面透光石英比色皿。

1.2.3 前表面熒光光譜技術(shù)與透射熒光光譜技術(shù)的對(duì)比

選用100 μg/L的乙腈隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液，置于4 mL比色皿中，分別用透射和前表面光譜法進(jìn)行掃描。于激發(fā)波長(zhǎng)為220～420 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為220～620 nm內(nèi)測(cè)定光譜圖。

1.2.4 溶劑優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取4份0.0040 g隱性孔雀石綠顆粒置于4 mL離心管中，分別加入4 mL苯、甲苯、石油醚、乙腈溶劑，振蕩搖勻，按1.2.1的方法配制不同溶劑的孔雀石綠儲(chǔ)備液，再移取配制好的4種儲(chǔ)備液稀釋配制成100μg/L的隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液以及4種空白溶劑，置于比色皿中，掃描熒光光譜圖。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用優(yōu)化后的最佳測(cè)試條件，分別測(cè)定1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90μg/L和100 μg/L的隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液的熒光強(qiáng)度。以隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

對(duì)獲得的原始熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)繪圖軟件選用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 LMG的最佳波長(zhǎng)

在激發(fā)波長(zhǎng)范圍220～420 nm、增量5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍220～620 nm、增量5 nm，掃描的狹縫為5 nm，掃描隱性孔雀石綠（LMG）熒光吸收光譜，如圖2所示。在吸收光譜中最大熒光強(qiáng)度（吸光值）對(duì)應(yīng)的熒光波長(zhǎng)稱為最佳熒光波長(zhǎng)，隱性孔雀石綠（LMG）最佳的激發(fā)波長(zhǎng)為265 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為360 nm。

圖2 100μg/L隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液掃描光譜

2.2 前表面熒光光譜技術(shù)與透射熒光光譜技術(shù)的對(duì)比

圖3a和圖3b分別為前表面熒光和透射熒光光譜圖對(duì)應(yīng)的等高線光譜圖，橫坐標(biāo)為熒光發(fā)射波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為激發(fā)波長(zhǎng)，在λem-λex構(gòu)成的等高線自外向內(nèi)表示熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，每條等高線為50熒光強(qiáng)度。在同一條件下，LMG乙腈溶液的前表面熒光光譜對(duì)應(yīng)的等高線光譜圖3a比熒光透射光譜對(duì)應(yīng)的等高線光譜圖3b的圈數(shù)多，即前表面熒光技術(shù)比熒光透射更為靈敏。

圖3 100μg/L隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液的等高線譜圖

2.3 最佳溶劑的優(yōu)化

如圖4所示，在萃取劑體積固定的情況下，分別用苯、甲苯、乙醚和乙腈對(duì)LMG進(jìn)行萃取，配制成100 μg/L的乙腈萃取溶液并用前表面熒光掃描得到相應(yīng)的等高線譜圖，結(jié)果顯示苯和甲苯中LMG的熒光峰出現(xiàn)偏移。王碧等[9]人通過(guò)對(duì)苯系物三維熒光光譜特征的研究，提出了苯、甲苯均有一個(gè)明顯的熒光峰，均與MG特征峰位置相接近，由此產(chǎn)生溶劑效應(yīng)。由此可分析，用苯、甲苯作為孔雀石綠的溶劑時(shí)，孔雀石綠中的熒光體與兩種溶劑中的熒光體相互產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致了孔雀石綠熒光特征峰的偏移。乙醚存在比較多雜峰，且與隱性孔雀石綠（LMG）峰出現(xiàn)了重疊現(xiàn)象，宋春元等[10]經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在發(fā)射波長(zhǎng)290～ 345 nm 范圍內(nèi)乙醚的水溶液存在熒光譜帶，在這一范圍內(nèi)存在許多乙醚熒光峰，對(duì)判斷隱性孔雀石綠熒光峰產(chǎn)生了干擾。所以乙腈的萃取效果優(yōu)于其他有機(jī)溶劑體系。

2.4 LMG溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化的方法條件下，選擇最佳的激發(fā)波長(zhǎng)λex=265 nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng) λem=360 nm，以隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。線性方程為Y=3.5318X+13.069，線性范圍為 0.25 ～ 100 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.9974，在空白乙腈中添加LMG標(biāo)準(zhǔn)樣品，以S/N=1.435時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法的檢出限，乙腈中LMG的最低檢出限為14.35 μg/L，低于這個(gè)濃度時(shí)，隱性孔雀石綠的熒光特性受濃度與光照的影響，其熒光特性產(chǎn)生巨大的變化，影響檢測(cè)結(jié)果。本研究方法具有快速、靈敏度高的特點(diǎn)，基于此方法可判定乙腈萃取水產(chǎn)品中LMG的殘留量，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

圖4 不同萃取劑及100μg/L隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液等高線譜圖

圖5 隱性孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)的水產(chǎn)品中的MG和LMG的常用檢測(cè)方法有高效液相色譜法、分光光度法和酶聯(lián)免疫檢測(cè)法等。實(shí)際檢測(cè)中主要采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法，在測(cè)定時(shí)須將代謝產(chǎn)物L(fēng)MG時(shí)需氧化還原成MG，該檢測(cè)過(guò)程頗為復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)、耗量大且只能利用保留時(shí)間來(lái)定性，有一定的局限性[13]；采用分光光度計(jì)一般只用于檢測(cè)水體中的LMG，其靈敏度較低，準(zhǔn)確度較差；酶聯(lián)免疫檢測(cè)法主要用于的商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒，以MG為靶標(biāo)，不能直接檢測(cè)LMG，因而需將LMG轉(zhuǎn)變成MG，使樣品前處理變得復(fù)雜，且轉(zhuǎn)化率難以控制[14]。前表面熒光光譜具有前處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、成本低、檢測(cè)限量低等優(yōu)點(diǎn)，適用于檢測(cè)LMG在水產(chǎn)品中的殘留量。

前表面熒光光譜法容易受到許多因素的影響，例如濃度、分子環(huán)境和光學(xué)散射等。因此，利用前表面熒光激發(fā)-發(fā)射光譜研究隱性孔雀石綠（LMG）的熒光特性時(shí)，需先選擇LMG的最佳波長(zhǎng)，減少誤差。在樣品優(yōu)化條件下，隱性孔雀石綠乙腈標(biāo)準(zhǔn)液的濃度與熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系，為檢測(cè)隱性孔雀石綠的殘留提供新的技術(shù)手段。

本研究基于前表面熒光技術(shù)研究隱性孔雀石綠（LMG），是為了能快速檢測(cè)隱性孔雀石綠，節(jié)省資源并對(duì)建立快速檢測(cè)水產(chǎn)中的隱性孔雀石綠的提供方法。

4 結(jié)論

基于前表面熒光光譜法檢測(cè)隱性孔雀石綠，測(cè)定的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為265 nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)為360 nm。以苯、甲苯、乙醚和乙腈為萃取劑，可判定乙腈作為L(zhǎng)MG的萃取劑較為合適。在優(yōu)化的條件下，本研究方法的線性范圍為0.25～100μg/L，線性方程為Y=3.5318X+13.069，線性范圍為0.25～100μg/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.9974，最低檢出限為0.25μg/L。為檢測(cè)水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠（LMG）的殘留提供新的技術(shù)手段。