富硒蛹蟲草對(duì)小白鼠急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

劉沐欣，趙南南，王澤，徐方旭，柳葉飛，王升厚＊

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧沈陽(yáng) 110034）

蛹蟲草又稱北蟲草、北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬于麥角菌科，為蟲草屬的模式菌種，在化學(xué)成分上和保健功能上與冬蟲夏草相似，具有抗腫瘤、提高免疫力、抗炎、抗氧化以及延緩衰老等作用。目前對(duì)蛹蟲草人工栽培、化學(xué)成分和功效方面研究較多，對(duì)于蛹蟲草毒性研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用急性毒理實(shí)驗(yàn)對(duì)蛹蟲草的食用安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為蛹蟲草的安全食用量提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為蛹蟲草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試蛹蟲草材料：富硒蛹蟲草馬氏一號(hào)（代號(hào)：MS82），人工培育，子實(shí)體中硒含量82 mg/kg；普通蛹蟲草（代號(hào)：PT356），采用自然飲用水灌胃，為遼寧蛹蟲草栽培基本配方；空白組，采用自然飲用水灌胃。上述材料全部來(lái)源于沈陽(yáng)師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所，蛹蟲草全株使用。45 ℃真空干燥后研磨成粉，80目篩子過(guò)篩3次，干燥儲(chǔ)存。按實(shí)驗(yàn)要求用自然飲用水配制所需濃度的蛹蟲草溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

昆明系SPF級(jí)小鼠、體重18～20 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。于溫度（24±2）℃、濕度55%±5%、自由采食和飲水飼養(yǎng)2～3 d，以適應(yīng)新的環(huán)境。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、白蛋白（ALB）試劑盒、尿素氮（BUN）試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；PBS緩沖液等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

將小鼠隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組10只，雌雄各半，用于急性毒理學(xué)研究。等量灌胃，空白組：自然飲用水；對(duì)照組：普通蛹蟲草，按規(guī)定配制灌胃懸濁液；實(shí)驗(yàn)組：富硒蛹蟲草，按規(guī)定配制灌胃懸濁液。

1.3.2 急性毒理實(shí)驗(yàn)

依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2009年3號(hào)公告，批準(zhǔn)蛹蟲草子實(shí)體為新資源食品，公告中規(guī)定正常成人使用量為2 g/人·d，成人體重按60 kg計(jì)，急性毒理實(shí)驗(yàn)采用一日給予最大劑量，即人推薦量的100倍劑量。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的灌胃量為641.0 mg/只，24 h內(nèi)分兩次灌胃給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，間隔9 h，每次灌胃量為0.5 mL。觀察15天，每天觀察小鼠的行為、毛發(fā)、精神狀態(tài)等，日記錄各組小鼠飲水量、飲食量，每隔3天稱量小鼠體重。

1.3.3 解剖觀察

急性毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉小鼠，稱量體重。心臟取血，將血液樣品收集到1.5 mL離心管中，室溫靜置 2 h 后，4 ℃，5 000 r/min 離心 5 min，取上清液-80 ℃儲(chǔ)存待用。尸檢觀察器官的變化，迅速解剖肝臟、腎臟、脾、胸腺、胃、腸等臟器，PBS緩沖液中洗滌，在濾紙上吸干后，稱重記錄，并計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器重量（mg）/體重（g）×100%。

1.3.4 小鼠血生化指標(biāo)檢測(cè)

根據(jù)試劑盒指定實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。每組隨機(jī)選取5只小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，每只小鼠檢測(cè)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，數(shù)據(jù)處理及組間顯著性采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠外部形態(tài)

如圖1所示，在為期15天的急性毒理實(shí)驗(yàn)中，隨著天數(shù)的增加，相較于空白組，實(shí)驗(yàn)組小鼠相較于空白組相比，逐漸出現(xiàn)精神低迷、行動(dòng)遲緩、食欲不振、活動(dòng)量減少、身體佝僂及毛色偏黃等中毒癥狀；從第4天起開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束有4只小鼠死亡，空白組及普通組均未出現(xiàn)明顯中毒和異?，F(xiàn)象。

圖1 實(shí)驗(yàn)組硒中毒小鼠形態(tài)

2.2 體重測(cè)定結(jié)果

如圖2所示，三組小鼠的體重均呈上升的趨勢(shì)，對(duì)照組小鼠的體重略低于空白組（p＞0.05）。實(shí)驗(yàn)初期，實(shí)驗(yàn)組體重出現(xiàn)降低，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，體重增加緩慢，在三組中最低（p＜0.05）。其中，實(shí)驗(yàn)組死亡個(gè)體體重明顯偏輕，顯著低于空白組和對(duì)照組（p＜0.05），且對(duì)照組雄性小鼠體重增加大于雌性，而實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠的體重均小于雌性小鼠。

圖2 急性染毒15天各組小鼠體重變化

2.3 飲水量測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，三組小鼠的飲水量均呈上升的趨勢(shì)，對(duì)照組小鼠的飲水量略低于空白組（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組小鼠的飲水量最低，顯著低于空白組和對(duì)照組（P＜0.05）。

圖3 急性染毒15天各組小鼠飲水量變化

2.4 飲食量測(cè)定結(jié)果

如圖4所示，隨著實(shí)驗(yàn)開展，觀察發(fā)現(xiàn)三組小鼠的飲食量均呈上升的趨勢(shì)，對(duì)照組小鼠的飲食量略低于空白組，不具有顯著性差異（p＞0.05），實(shí)驗(yàn)組小鼠的飲食量最低，顯著低于空白組和對(duì)照組（p＜0.05）。空白組和對(duì)照組雄性小鼠的飲食量大于雌性小鼠，而實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠的飲食量小于雌性小鼠。

圖4 急性染毒15天各組小鼠飲食量變化

2.5 臟器指數(shù)

如表1所示，在腎臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及胃指數(shù)方面，各組之間均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。此外，對(duì)照組與空白組肝臟指數(shù)無(wú)顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組肝臟指數(shù)偏大，與空白組和對(duì)照組均存在顯著性差異（p＜0.05）。其中，實(shí)驗(yàn)組胸腺解剖出現(xiàn)發(fā)育不良狀況。

表1 蛹蟲草對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

2.6 血生化指標(biāo)檢測(cè)

如表2所示，在AST活力、ALB含量、BUN濃度方面，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組小鼠與空白組無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。對(duì)各組小鼠ALT活力進(jìn)行顯著性分析，可知對(duì)照組小鼠與空白組不存在顯著性差異（p＞0.05），實(shí)驗(yàn)組小鼠ALT活力與空白組和對(duì)照組均存在顯著性差異（p＜0.05）。受損，結(jié)合臟器指數(shù)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的蛹蟲草對(duì)小鼠肝臟有較大的影響和毒性作用。

表2 蛹蟲草對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與技術(shù)評(píng)價(jià)規(guī)范》可知，當(dāng)LD50大于或等于100倍者時(shí)（即死亡數(shù)量小于或等于一半），可以進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)，代表實(shí)驗(yàn)組蛹蟲草滿足作為保健食品要求，且之前對(duì)該蟲草進(jìn)行了10倍濃度的亞急性毒理學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)，可初步確定10倍濃度（20 g/人·d）為安全劑量。

3 結(jié)論

急性毒理實(shí)驗(yàn)顯示，空白組和對(duì)照組的蛹蟲草對(duì)小鼠無(wú)明顯的影響作用，而實(shí)驗(yàn)組的蛹蟲草對(duì)小鼠具有明顯的毒性作用，主要表現(xiàn)為小鼠體重、飲食和飲水量均減少，且雄鼠體重飲食飲水皆低，說(shuō)明雄性小鼠較雌性小鼠更容易受蟲草劑量影響。谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活力、白蛋白（ALB）含量、尿素氮（BUN）濃度三組無(wú)顯著性差異，代表肝功能及腎功能基本正常，但是實(shí)驗(yàn)組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的變化，代表肝臟