甲醛對(duì)魷魚肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

李穎暢 宋素珍 楊鐘燕 楊賢慶 魏 涯 王 曉 仇長璐 沈 琳 勵(lì)建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧錦州121013 2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣州510641 3 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連116101）

甲醛 （formaldehyde，F(xiàn)A） 是一種活性反應(yīng)物質(zhì)，能夠與蛋白質(zhì)的許多官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，尤其是側(cè)鏈游離氨基酸。理論上一個(gè)FA 分子能夠與兩個(gè)氨基反應(yīng)，通過相鄰多肽的亞甲基橋形成分子內(nèi)和分之間的交聯(lián)[1]，從而使蛋白質(zhì)溶解度降低，產(chǎn)品質(zhì)地硬化、纖維化等，降低產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值[2]。據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，當(dāng)FA 存在時(shí)，在一定條件下部分氨基酸（賴氨酸、酪氨酸等）與其發(fā)生反應(yīng)。Chanarat 等[4]研究表明，貯藏過程中狗母魚魚糜中FA 含量的增大和蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致魚糜凝膠形成性變差，魚糜凝膠的破斷力增大，影響其品質(zhì)。Sikorski 等[5]報(bào)道FA 與蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的溶解性下降。秘魯魷魚，資源豐富且營養(yǎng)價(jià)值高，目前已成為我國重要的經(jīng)濟(jì)類海產(chǎn)品。因其無骨刺、易加工以及食用比例高（比一般魚類的可食比例高出20%左右）等優(yōu)點(diǎn)而日益受到魚糜生產(chǎn)者的關(guān)注，目前主要加工產(chǎn)品為魷魚絲、魷魚串或者魚丸。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，魷魚等水產(chǎn)品中含有較高含量的FA 和二甲胺（dimethylamine，DMA）[6]。為此本試驗(yàn)以秘魯魷魚肌原纖維蛋白為研究對(duì)象，通過體外模擬向其中加入一定濃度的FA 溶液，熱誘導(dǎo)形成凝膠，探討FA 對(duì)魷魚肌原纖維蛋白凝膠特性及結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秘魯魷魚，錦州市林西路水產(chǎn)市場；食鹽，錦州市新瑪特超市；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、2-硝基苯甲酸（DTNB），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；曲拉通X-100（TritonX-100），北京化學(xué)試劑公司；氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、脲素，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；濃鹽酸，錦州市古城化學(xué)試劑廠；甲醛溶液，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；25%戊二醛溶液，天津市福晨化學(xué)試劑廠；β-巰基乙醇，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；以上試劑無特殊說明皆為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

MS105DU 電子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；FE20 型pH 計(jì)，美國METTLER TOLEDO 公司；UV-2550 紫外-可見分光光度儀，島津儀器（蘇州）有限公司；CR-400 色彩色差計(jì)、S4800 場發(fā)射掃描電鏡、E-1045 鍍金儀，日本Minolta 公司；NM120 低場核磁共振儀，上海紐邁電子科技有限公司；THERMO X1R 冷凍高速離心機(jī)，美國Thermo 公司；HH-6 恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取 參照Bertram 等[7]方法，略作修改。將秘魯魷魚自然解凍，去皮，取酮體肉，加3 倍體積A 液 （0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）和1 倍體積B 液（1% Triton X-100、0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 7.5），均質(zhì)（10 000 r/min，30 s，至少6 次，以防過熱），紗布過濾（除去結(jié)締組織），離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min），去上清液，沉淀用4 倍體積A 液浸提，重復(fù)4 次，所得沉淀即肌原纖維蛋白。用雙縮脲法測定其蛋白質(zhì)含量，所有操作均在4℃條件下進(jìn)行，貯存在-80 ℃超低溫冰箱中，備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白凝膠的制備 參考Chanarat等[4]的方法，略作修改。將肌原纖維蛋白從-80 ℃超低溫冰箱取出，置4 ℃冰箱內(nèi)過夜解凍，加3%的氯化鈉并分別添加甲醛 （0，1，2，3，4 和5 μL/g蛋白），4 ℃氧化3 h，轉(zhuǎn)入直徑為25 mm 的柱形小瓶中，4 000 r/min 離心2 min （除氣泡），40 ℃恒溫水浴中加熱50 min，再90 ℃加熱30 min，冰水冷卻15 min，取出后置4 ℃冰箱內(nèi)過夜，待測。

1.3.3 白度的測定 先將樣品置室溫下30 min，用CR-400 色差計(jì)測定蛋白凝膠的L*，a*和b*值，每組樣品平行測5 次，取平均值。白度值通過以下公式[8]計(jì)算：

1.3.4 質(zhì)構(gòu)（TPA）的測定 采用TA-XTplus 型質(zhì)構(gòu)儀測定，探頭為P/50，測試前速度2.0 mm/s，測試中速度1.5 mm/s，測試后速度1.5 mm/s，壓縮比40%，下壓力為5.0 g[9]。

1.3.5 破斷力和凹陷距離的測定 利用 TAXTplus 型質(zhì)構(gòu)儀的凝膠強(qiáng)度測定模式分析魚糜凝膠的破斷力和凹陷距離。測定條件：探頭：P/5S 球形金屬探頭；測前速度2.0 mm/s，測中速度1.0 mm/s，測后速度1.0 mm/s；測試距離15.0 mm；觸發(fā)力10.0 g[9]。

1.3.6 持水性和蒸煮損失率的測定 參考Ma等[10]的方法并略作修改。

持水性測定：取制備好的魚糜凝膠樣品切成0.5 cm 的薄片，準(zhǔn)確稱重（W1），樣品用3 層濾紙裹住后裝入50 mL 的離心管 （底部墊有適量棉花）中，采用冷凍高速離心機(jī)5 000 r/min 離心15 min，立即取出樣品并再次稱重（W2）。持水性的計(jì)算公式：

蒸煮損失率測定：取魚糜凝膠樣品切成5.0 mm 的薄片并稱重（G1），封于蒸煮袋中，于90 ℃水浴鍋中蒸煮20 min，快速取出，擦干表面液體后再次稱重（G2）。根據(jù)公式計(jì)算樣品蒸煮損失。

1.3.7 低場核磁共振分析 參考余永名等[11]的方法。測定參數(shù)：重復(fù)間隔時(shí)間TR（ms）：3 000；采樣間隔時(shí)間EchoTime（μs）：150；重復(fù)掃描次數(shù)NS：8；回波個(gè)數(shù)EchoCnt：3 500。所得CPMG 指數(shù)衰減曲線采用儀器自帶的MultiExp Inv Analysis 軟件進(jìn)行反演，得到T2值。

1.3.8 總巰基和活性巰基的測定 取絞碎后的蛋白凝膠，加入3 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl（含0.6 mol/L KCl，pH 7.5），高速均質(zhì)，4 500 g 離心20 min（4 ℃），采用雙縮脲法測定上清液蛋白質(zhì)的濃度，備用。

取上述樣品蛋白溶液并將其濃度調(diào)至適宜濃度，參考Yongsawatdigul[14]方法測定。取1 mL 蛋白溶液，每管中加入9 mL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（包括0.6 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，8 mol/L 的尿素，pH.0）。充分混合后取5 mL，加入0.5 mL DTNB（79.2 mg 溶于20 mL pH 7.0 的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中），25 ℃保溫25 min，于412 nm 處測定吸光度即總巰基的吸光度?；钚詭€基的測定是在不含尿素的情況下，將反應(yīng)混合液在4 ℃反應(yīng)60 min，于412 nm 處測定其吸光度。使用分子吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm） 計(jì)算蛋白中總巰基含量。

1.3.9 表面疏水性 參考Chelh 等[15]方法并稍作修改。各取1 mL 肌原纖維蛋白溶液，加入0.2 mL溴酚藍(lán)（1 mg/mL）溶液，室溫靜置10 min，然后于4 000 r/min 離心15 min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在波長595 nm 處測定樣品的吸光度值，空白用磷酸鹽緩沖溶液替代蛋白液。表面疏水性用溴酚藍(lán)可結(jié)合的暴露出包埋在蛋白質(zhì)構(gòu)象內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基的量來表示，計(jì)算公式：

1.3.10 化學(xué)作用力 參考Gómez-Guillén 等[12]的方法：取2.0 g 蛋白凝膠樣品5 份，分別加入0.05 mol/L NaCl （A 液）、0.6 mol/L NaCl （B 液）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素（C 液）、0.6 mol/L Na-Cl+ 8.0 mol/L 尿素 （D 液）、0.6 mol/L NaCl+ 8.0 mol/L 尿素+ 0.05 mol/L β-巰基乙醇（E 液）5 種溶液共10 mL，經(jīng)均質(zhì)混勻，于4 ℃靜置60 min，10 000 r/min 離心15 min，取上清液用雙縮脲法測定其中的蛋白質(zhì)含量。

離子鍵=溶解于B 液中的蛋白質(zhì)含量-A 液中的蛋白質(zhì)含量；

氫鍵=溶解于C 液中的蛋白質(zhì)含量-B 液中的蛋白質(zhì)含量；

疏水相互作用=溶解于D 液中的蛋白質(zhì)含量-C 液中的蛋白質(zhì)含量；

二硫鍵=溶解于E 液中的蛋白質(zhì)含量-D 液中的蛋白質(zhì)含量。

結(jié)果以每升溶液所含溶出蛋白質(zhì)的量來表示（g/L）。

1.3.11 電鏡掃描觀察（SEM）

參考Oujifard[13]的方法：魚糜凝膠樣品→切塊（3 mm×3 mm×2 mm）→2.5%戊二醛溶液[含50%濃度為0.2 mol/L，pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液（PBS）]固定24 h→去除固定液→PBS （0.2 mol/L，pH 7.2）漂洗3 次 （15 min/次）→蒸餾水沖洗60 min→50%，70%和90%的乙醇梯度脫水各1 次 （15 min/次）→無水乙醇洗脫3 次 （10 min/次）→真空冷凍干燥→離子濺射鍍金→掃描電鏡觀察。

1.3.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 9.0，SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，處理結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白凝膠白度的變化

白度是魚糜制品品質(zhì)鑒定的重要指標(biāo)之一，決定魚糜制品在感官上被消費(fèi)者接受的程度。白度與魚糜制品色澤中的L*值、a*值、b*值密不可分，通過分析L*、a*、b*值來綜合評(píng)價(jià)白度的變化。亮度（L*）值，從0 到100 變化，0 表示黑色，100 表示白色；紅/綠（a*）值表示從紅到綠的值，正值代表紅色程度，負(fù)值代表綠色程度；黃/藍(lán)（b*）值表示從黃到藍(lán)的值，正值表示黃色程度，負(fù)值表示藍(lán)色程度。表1是甲醛（FA）含量對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠白度的影響，由表1可以看出，隨著FA 含量的增加，蛋白凝膠的白度值、L*值和b*值顯著（P＜0.05）增大，a*值顯著（P＜0.05）減小，而不同濃度的FA 間a*無顯著性變化。白度變化可能與蛋白質(zhì)的聚集程度和聚集速度有關(guān)，F(xiàn)A 添加量越多，蛋白聚集速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蛋白伸展速率，破壞了蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，推測蛋白聚集過程中反射更多的光，或者是FA 使蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致蛋白凝膠白度增加；其中L*值、b*值增大可能是隨著FA含量的增加，蛋白凝膠中水分流失多，水分流動(dòng)性增強(qiáng)，內(nèi)部水分向表層遷移[16]。

表1 甲醛對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Table 1 Effect of FA on whiteness value of myofibrillar protein gels from Peru squid

2.2 肌原纖維蛋白凝膠破斷力和凹陷距離的變化

破斷力即探頭刺破凝膠時(shí)所感應(yīng)到的力，可反映凝膠制品的硬度；凹陷距離指凝膠在外力作用下即將斷裂時(shí)所發(fā)生的形變量，反映凝膠制品的彈性以及凝膠中蛋白質(zhì)分子間作用力的強(qiáng)弱[17]。從圖1可知，F(xiàn)A 的存在對(duì)蛋白凝膠的破斷力和凹陷距離影響顯著（P＜0.05）。當(dāng)FA 含量為0時(shí)，蛋白凝膠破斷力為最小，凹陷距離最大，即該組的彈性最好，其凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較致密。隨著FA 含量的增加，蛋白凝膠破斷力顯著增大（P＜0.05），與硬度變化一致。Sikorski 等[18]發(fā)現(xiàn)FA 是蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，通過亞甲基橋作用于多肽分子間或者分子內(nèi)部，這些鍵能促使蛋白凝膠有更大的破斷力。Chanarat 等[4]報(bào)道FA 的存在可以增加魚糜凝膠的破斷力。隨著FA 含量的增加，蛋白凝膠凹陷距離顯著降低（P＜0.05），這可能是由于FA 含量的增加促使蛋白質(zhì)過度聚集和蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性的原因。Benjakul 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與其它魚種魚糜相比，凍藏狗母魚魚糜凝膠形成性差，主要原因就是FA 的生成。

2.3 肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性分析

圖1 甲醛對(duì)魷魚肌原纖維蛋白凝膠的破斷力（A）和凹陷距離（B）的影響Fig.1 Effect of FA on breaking force （A） and deformation （B） of myofibrillar protein gels from Peru squid

凝膠質(zhì)構(gòu)（TPA）主要通過模擬人口腔的兩次咀嚼動(dòng)作，對(duì)測試樣品進(jìn)行兩次壓縮，獲得與人感官評(píng)定相對(duì)應(yīng)的參數(shù)。由表2可以看出，F(xiàn)A 含量為0 時(shí)，樣品的硬度、彈性和咀嚼度分別是1 357.98 g，0.986 和1 220.53 g·mm；隨著FA 含量的增大，蛋白凝膠的硬度和咀嚼度呈現(xiàn)上升的趨勢（P＜0.05），彈性則有一定程度的減弱，然而無顯著性變化（P＞0.05）；在FA 含量為5.0 μL/g 蛋白時(shí)，硬度和咀嚼度分別達(dá)到1 830.65 g，1 635.01 g·mm，比FA 含量為0 時(shí)分別增大了34.8%，34.00%。FA 能夠和肽類、氨基酸殘基等小分子質(zhì)量物質(zhì)反應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)部交聯(lián)，溶解度下降，其質(zhì)地變硬，變脆[2]，進(jìn)而可使魷魚肌原纖維蛋白凝膠樣品硬度和咀嚼度增大。

表2 甲醛對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Effect of FA on textural properties of myofibrillar protein gels from Peru squid

2.4 肌原纖維蛋白凝膠持水性和蒸煮損失率的變化

持水性是反映蛋白凝膠對(duì)其中水分的保持能力，持水性能高的蛋白凝膠，內(nèi)部水分不易外滲，因而在凝膠受到外力擠壓時(shí)失水率低。蛋白凝膠的蒸煮損失是指在凝膠蒸煮過程中水分等易流失物質(zhì)因滲出所造成的質(zhì)量減少。蒸煮損失率越大，表明蛋白凝膠水分等物質(zhì)在受熱蒸煮時(shí)越易流失。持水性和蒸煮損失可間接反映蛋白凝膠微空間三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密程度。持水性越高，蒸煮損失越低，表明魚糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)水分等物質(zhì)的束縛能力越強(qiáng)，也就是說蛋白凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密。圖2反映FA 含量對(duì)魷魚蛋白凝膠持水性和蒸煮損失的影響。樣品蛋白凝膠的持水性隨著FA 含量的增加呈下降趨勢，而蒸煮損失率則是顯著（P＜0.05）增大。隨著FA 含量的增加，蛋白凝膠樣品與未加甲醛的蛋白凝膠樣品相比持水性分別下降1.86%，13.81%，20.62%，22.68%，27.22%。凝膠持水性的降低與蛋白結(jié)構(gòu)變化密不可分。秘魯魷魚肌原纖維蛋白經(jīng)FA 氧化后形成的凝膠結(jié)構(gòu)松散，蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)斷裂，聚集成塊狀，這可能是持水性下降的原因。Xiong 等[20]也發(fā)現(xiàn)，氧化后的豬肉肌原纖維蛋白形成的凝膠結(jié)構(gòu)多孔，其持水性明顯下降。

圖2 甲醛對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠的持水性和蒸煮損失的影響Fig.2 Effect of FA on water-holding capacity and cooking loss of myofibrillar protein gels from Peru squid

2.5 肌原纖維蛋白凝膠橫向弛豫時(shí)間T2 的變化

低場NMR 技術(shù)可以用來檢測樣品中水的移動(dòng)性和分布狀態(tài)。一般選用T2弛豫時(shí)間分析樣品中水分的移動(dòng)及分布[21]。T2值的大小可以反映水分流動(dòng)性的強(qiáng)弱[22]。從圖3得知，魷魚肌原纖維蛋白凝膠樣品中水分分布主要呈現(xiàn)為4 個(gè)狀態(tài)：T21（0.23～0.76 ms）、T22（0.99～3.05 ms）、T23（43.29～114.98 ms）、T24（305.39～464.16 ms）。其中T21、T22代表蛋白凝膠中的結(jié)合水[23]。T21是指與蛋白質(zhì)等大分子表面的極性基團(tuán)以氫鍵相結(jié)合的單層水，以及位于大分子固有結(jié)構(gòu)上的質(zhì)子[24]；T22與蛋白質(zhì)中的酰胺基形成的具有較小鍵能的氫鍵的一部分水分，與T21代表的水分群相比，較之結(jié)合能力稍弱[25]；T23代表蛋白凝膠中可移動(dòng)的水分群，稱為可移動(dòng)水，位于蛋白質(zhì)空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)空隙及膜所阻留的那部分水即為束縛水[26]，是蛋白凝膠中水分的主要存在形式，占凝膠總水分的90%左右；T24代表自由水，是蛋白凝膠中結(jié)合最差的水分，是存在于細(xì)胞外的水。

圖4顯示FA 含量不同的蛋白凝膠弛豫組分峰面積比例變化情況。其中P21、P22、P23、P24分別對(duì)應(yīng)弛豫組分T21、T22、T23、T24的峰面積百分比，即代表各部分水占總水分的比例。根據(jù)蛋白凝膠樣品弛豫組分峰面積百分比，可以估算氫質(zhì)子的相對(duì)含量，反映不同狀態(tài)水分群的含量，而根據(jù)不同狀態(tài)水分群含量的變化，可以評(píng)估各種狀態(tài)水分群的遷移情況[27]。由圖4可知，P21、P22占蛋白凝膠總水分的比例最小，隨著FA 含量的增加，其變化幅度不明顯，說明FA 對(duì)蛋白凝膠樣品中結(jié)合水水群影響不顯著（P＞0.05）。而P23明顯是4 個(gè)水分群分布狀態(tài)中比例最高的，是蛋白凝膠中含量最多的水分，其與P24的分布情況將直接關(guān)系蛋白凝膠的持水性能。由圖4可得知，隨著FA 含量的增加，P23和P24二者正好呈現(xiàn)相反的變化趨勢，P23顯著（P＜0.05）降低，P24呈升高的趨勢，即蛋白凝膠的保水能力越來越差，表明FA 破壞了蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)斷裂，內(nèi)部被束縛住的水分流出，自由水所占比例增大，該結(jié)果與持水性和蒸煮損失結(jié)果一致。內(nèi)部被束縛的水的流出越多，水的流動(dòng)性越大，其持水性減弱，蒸煮損失率越大。

2.6 肌原纖維蛋白凝膠總巰基和活性巰基含量的變化

蛋白質(zhì)中巰基（-SH）和二硫鍵（-S-S-）是具有最高反應(yīng)活性的基團(tuán)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[28]與巰基和二硫鍵的變化密切相關(guān)；蛋白質(zhì)發(fā)生氧化時(shí)，巰基可轉(zhuǎn)化為二硫鍵，并且隨著氧化程度的增大還會(huì)生成亞砜等氧化產(chǎn)物[29]。巰基含量的變化可作為蛋白質(zhì)性質(zhì)變化的一個(gè)重要指標(biāo)。

圖3 秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠T2 橫向弛豫時(shí)間的分布變化Fig.3 Change of distributed T2 transverse relaxation time of myofibrillar protein gel from Peru squid

圖5所示FA 含量對(duì)肌原纖維蛋白凝膠總巰基和活性巰基含量的影響。隨著FA 含量的增加，肌原纖維蛋白凝膠的總巰基和活性巰基含量呈顯著（P＜0.05）下降趨勢。當(dāng)FA 為0 μL/g 蛋白時(shí)，蛋白凝膠總巰基和活性巰基含量分別為29.72，20.53 nmol/mg 蛋白；當(dāng)FA 為1 μL/g 蛋白時(shí)，總巰基和活性巰基分別下降到15.01，13.68 nmol/mg 蛋白，減少率分別達(dá)49.5%，33.4%；當(dāng)FA≥1 μL/g蛋白時(shí)蛋白凝膠的總巰基和活性巰基含量減少趨于平緩。蛋白質(zhì)中的游離巰基包括2 種：暴露在蛋白質(zhì)表面的巰基和包埋在疏水基團(tuán)內(nèi)部的巰基。巰基減少的原因可能是FA 與肽類、氨基酸殘基等小分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)，破壞了蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致更多的巰基被氧化成二硫鍵或是進(jìn)一步氧化成磺酸類或其它氧化產(chǎn)物，從而使蛋白結(jié)構(gòu)表面巰基含量下降[30]。Lund等[31]研究豬背最長肌在冷藏條件下蛋白質(zhì)的變化情況，巰基含量的降低在一定程度上代表了蛋白氧化的程度。

2.7 表面疏水性

圖4 甲醛處理對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠弛豫組分峰面積比例變化的影響Fig.4 Effect of FA on change of peaks area proportion of myofibrillar protein gels from Peru squid

蛋白質(zhì)表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量，是影響蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和功能特性的重要指標(biāo)，可將其用作衡量蛋白質(zhì)變性程度的一個(gè)指標(biāo)[32]。通常蛋白質(zhì)的一些疏水性氨基酸殘基埋藏于蛋白分子內(nèi)部，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，這些疏水性氨基酸殘基被暴露于分子表面，從而使蛋白質(zhì)的表面疏水性增加。另外，蛋白質(zhì)的疏水性還會(huì)受到不同氨基酸之間的疏水相互作用以及巰基氧化程度的影響[33]。圖6為不同濃度的FA 添加量對(duì)魷魚肌原纖維蛋白凝膠表面疏水性的影響，從圖中可看出，蛋白凝膠的表面疏水性隨著FA 濃度的增大而顯著增加（P＜0.05），當(dāng)FA 質(zhì)量濃度高于2 μL/g 蛋白時(shí)，表面疏水性變化不明顯。疏水相互作用是維持肌原纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要化學(xué)作用力，結(jié)合圖7，F(xiàn)A 含量引起魷魚肌原纖維蛋白凝膠表面疏水性的變化，F(xiàn)A 的存在促使肌原纖維蛋白快速聚集，蛋白聚集速率顯著高于蛋白伸展速率，使蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水性氨基酸殘基暴露，導(dǎo)致疏水值的增大。

2.8 化學(xué)作用力的變化

蛋白質(zhì)是一種具有三維空間結(jié)構(gòu)的生物高分子物質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)與功能之間存在密不可分的關(guān)系。FA 與蛋白質(zhì)能夠發(fā)生交聯(lián)形成復(fù)合物，對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)有影響，會(huì)改變分子內(nèi)和分子間的非共價(jià)作用力，使得其功能特性發(fā)生相應(yīng)的變化。離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵是維持肌原纖維蛋白三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力[34]。

圖5 甲醛對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠總巰基和活性巰基含量的影響Fig.5 Effect of FA on total sulfhydryl and active sulfhydryl content of myofibrillar protein gels from Peru squid

圖6 甲醛對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠表面疏水性的影響Fig.6 Effect of FA on surface hydrophobicity of myofibrillar protein gels from Peru squid

圖7 甲醛處理對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.7 Effect of FA on the chemical bonds of myofibrillar protein gels from Peru squid

圖7顯示FA 處理對(duì)肌原纖維蛋白凝膠中離子鍵、氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵的影響。由圖7可知，隨著FA 含量的增加，離子鍵、氫鍵和疏水相互作用呈現(xiàn)一定的下降趨勢（P＜0.05），而二硫鍵則是上升趨勢。氫鍵、疏水相互作用以及蛋白中的共價(jià)鍵對(duì)凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成具有重要的影響；蛋白質(zhì)的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)主要是通過離子鍵穩(wěn)定的。疏水相互作用是指蛋白質(zhì)中的非極性氨基酸殘基（疏水殘基）之間形成一種弱的、非共價(jià)的相互作用，這些疏水殘基在水相環(huán)境中具有避開水而相互聚集的傾向。疏水相互作用是蛋白質(zhì)發(fā)生折疊時(shí)的主要推動(dòng)力，可使疏水性殘基處在蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部，并且是影響大部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的關(guān)鍵作用力。通過骨架上的羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力；二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)特定分子結(jié)構(gòu)的形成有重要的作用[35]。

圖7表明，F(xiàn)A 含量對(duì)蛋白凝膠中離子鍵、氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵產(chǎn)生影響，相較于對(duì)照組，F(xiàn)A 存在時(shí)，隨著FA 含量的增加，離子鍵、氫鍵、疏水相互作用下降劇烈，這可能是因?yàn)镕A 與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，影響蛋白凝膠中蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，使結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；其次，推測二者的相互作用，使得蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不同側(cè)鏈間相互締合有所減少，而分子鏈內(nèi)部的聚合作用有所加強(qiáng)；當(dāng)FA 存在時(shí)，F(xiàn)A 使蛋白質(zhì)聚集速率高于蛋白質(zhì)伸展速率，不利于蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。另外，二硫鍵的增加可能是蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致巰基轉(zhuǎn)化形成。這些化學(xué)作用力的改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的改變，從而影響肌原纖維蛋白凝膠的理化性質(zhì)。

2.9 組織微觀結(jié)構(gòu)的變化

蛋白凝膠的組織微觀結(jié)構(gòu)主要是指凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的致密程度、孔徑的大小，以及結(jié)構(gòu)的平整程度均與肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度、持水性、蒸煮損失等呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。由圖8所示，經(jīng)FA 添加氧化后蛋白凝膠形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與未添加FA 氧化的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，隨著FA 添加量的增大，凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化更加明顯。未添加甲醛的蛋白樣品凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，結(jié)構(gòu)膠平整，分布均勻，結(jié)果與持水性、蒸煮損失率結(jié)果相一致；經(jīng)FA 處理的蛋白凝膠表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)不平整，粗糙，結(jié)構(gòu)分布不均勻，凝膠網(wǎng)絡(luò)空隙變大，肌原纖維發(fā)生斷裂現(xiàn)象。推斷是FA 通過蛋白質(zhì)交聯(lián)的亞甲基橋，使蛋白質(zhì)不能與鹽充分溶解，從而不能形成較好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，甚至是破壞凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[4]。另外，當(dāng)FA存在時(shí)，F(xiàn)A 和一些小分子物質(zhì)（肽類、氨基酸殘基等）發(fā)生反應(yīng)，使得樣品纖維化、硬化等。

圖8 甲醛處理對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effect of FA on microstructure of myofibrillar protein gels from squid

3 結(jié)論

FA 對(duì)肌原纖維蛋白凝膠特性及結(jié)構(gòu)影響顯著，主要表現(xiàn)在破斷力、凹陷距離、質(zhì)構(gòu)特性、持水性、蒸煮損失率有顯著變化，破斷力隨著FA 濃度的增大而顯著增大，凹陷距離顯著（P＜0.05）降低；持水性顯著減弱，蒸煮損失越來越大。經(jīng)FA 處理，秘魯魷魚肌原纖維蛋白凝膠巰基含量因蛋白構(gòu)象的改變而顯著減少，同時(shí)表面疏水性也因蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞而顯著增加；經(jīng)FA 氧化的肌原纖維蛋白凝膠組織微觀結(jié)構(gòu)顯示：FA 的存在破壞了肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，蛋白凝膠比對(duì)照組微觀結(jié)構(gòu)表面粗糙，空隙增大，分布不均勻。