綠豆肽對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖及免疫活性物質(zhì)的影響

楊 健 郭增旺 刁靜靜 馬 萍 李朝陽(yáng) 于 笛 王凱凱 張麗萍*

（1 國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心 黑龍江大慶163319 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 黑龍江大慶163319）

目前科學(xué)家們正在積極尋找和研究天然、安全的，可保證身體健康以及調(diào)節(jié)人體疲勞，增強(qiáng)免疫力的保健功能食品。在眾多的保健功能食品研究中，蛋白肽不乏是重點(diǎn)研究對(duì)象之一，尤其是水解形成多肽后的保健效果已被科學(xué)家廣泛認(rèn)可[1-2]。肽類(lèi)物質(zhì)被證實(shí)是涉及人體內(nèi)多種細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，可以合成細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能活動(dòng)[3-4]。我國(guó)有豐富的綠豆資源，綠豆被公認(rèn)為安全性高、無(wú)毒性的保健食品，受到國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。近年來(lái)對(duì)綠豆肽的保健機(jī)制研究越來(lái)越重視，尤其是免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究日益增多[5-6]。

綠豆肽（MBPs）具有提高人體免疫力的活性，能夠提高脾臟生成抗體細(xì)胞數(shù)、半數(shù)溶血值和小鼠的淋巴細(xì)胞增值力，同時(shí)能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力[7-8]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在機(jī)體中發(fā)揮著防御、監(jiān)視、調(diào)節(jié)以及抗原呈遞等極其重要的免疫作用，對(duì)于機(jī)體的免疫系統(tǒng)平衡非常重要[9-10]。巨噬細(xì)胞還具有重新構(gòu)建組織，修復(fù)損傷細(xì)胞，清除凋亡細(xì)胞的功能，因此巨噬細(xì)胞在宿主的免疫應(yīng)答過(guò)程中的作用不容忽視[11-12]?；罨木奘杉?xì)胞具有廣譜的殺菌作用，近幾十年來(lái)對(duì)免疫活性肽的藥理和臨床研究，一直把活化巨噬細(xì)胞作為一項(xiàng)重要的研究方向[13]，然而有關(guān)MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控作用還未有報(bào)道。本試驗(yàn)以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定MPBs 及MPBs+LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖活性、胞內(nèi)糖原、核酸、ATPase、LZM、SOD 等活性及細(xì)胞因子的分泌水平的影響，探討綠豆肽對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控作用，為綠豆肽的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

綠豆肽 （水解度32.25%），實(shí)驗(yàn)室自制；RAW264.7 細(xì)胞，武漢大學(xué)；DMEM 培養(yǎng)基，Gibco；胎牛血清，Hyclone；PBS，北京索萊寶科技有限公司；胰酶，碧云天；LPS，Biosharp；MTT 和DMSO，Sigma；PAS 染色液，Baso；吖啶橙和抗熒光淬滅劑，Solarbio；溶菌酶（LZM）檢測(cè)試劑盒，USCN；超氧化物歧化酶（SOD）WET-1 法測(cè)定試劑盒，南京建成；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，Wanleibo；細(xì)胞因子試劑盒，聯(lián)科生物有限公司；其它試劑為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要試劑的配制：MBPs 溶液，取100 mgMBPs溶解于5 mL 的PBS 中，過(guò)濾、滅菌，配成20 mg/mL 的使用液；LPS，將10 mg LPS 溶 于2 mL 的PBS 中，配成5 mg/mL 的儲(chǔ)存液；0.1 mol/L PBS，將29 g Na2HPO4、3 g NaH2PO4、85 g NaCl 溶 于500 mL 蒸餾水中，定容1 000 mL；0.01%吖啶橙，將10 mg 吖啶橙粉末溶于100 mL PBS 中，調(diào)節(jié)pH 4.8～6.0，過(guò)濾，避光保存。

1.2 設(shè)備、儀器

超純水系統(tǒng)（NW10LVF），Heal Force；超速冷凍離心機(jī)（H-2050R），湖南湘儀；CO2培養(yǎng)箱（HF-90），上海力申；倒置相差顯微鏡（AE31），麥克奧迪；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD），蘇州凈化；熒光顯微鏡 （BX53），OLYMPUS；酶標(biāo)儀 （ELX-800），BIOTEK。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MBPs 的制備方法 綠豆蛋白→加水（底物濃度1∶10）→加熱處理（95 ℃、10 min）→冷卻→調(diào)pH 8.5，溫度60 ℃→加3% Alcalase 2.4 L 堿性蛋白酶→恒溫、恒pH 水解3 h→滅酶 （95 ℃、10 min）→300 u 的透析袋流動(dòng)水透析脫鹽48 h→冷凍干燥→MPBs 固體粉末。

1.3.2 試驗(yàn)分組與處理 試驗(yàn)組1：LPS 組加入2 μg/mL 的LPS 處 理24 h；MBPs 組 分 別 加 入10，50，100，200 μg/mL 的綠豆肽處理24 h，對(duì)照組只加入等量PBS。

試驗(yàn)組2：LPS 組先培養(yǎng)4 h，再加入2 μg/mL的LPS 處理24 h；MBPs+LPS 組分先別加入10，50，100，200 μg/mL 的MBPs 處理4 h，再加入2 μg/mL 的LPS 處理24 h。RAW264.7 用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（含100 IU/mL 青霉素和100 IU/mL 鏈霉素） 在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰酶（含0.01% EDTA）消化，DMEM 培養(yǎng)基洗滌離心，PBS 重新洗滌離心后接種到培養(yǎng)皿中，6 孔板每孔500 μL，12 孔板每孔350 μL，按試驗(yàn)分組培養(yǎng)。收集6 孔板中各組細(xì)胞及上清液進(jìn)行蛋白及細(xì)胞因子相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)；收集12 孔板中各組細(xì)胞，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，進(jìn)行免疫活性成分相關(guān)檢測(cè)。

1.3.3 蛋白質(zhì)抽提與定量 蛋白質(zhì)抽提：根據(jù)細(xì)胞量加入9 倍體積的PBS，吹散至單細(xì)胞懸液，液氮反復(fù)凍融3 次，12 000 r/min 離心10 min，蛋白樣品在上清液中，在保證不吸入沉淀的操作下吸取所需上清液，于-20 ℃保存。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白設(shè)置不同濃度梯度，繪制濃度與吸光度值對(duì)應(yīng)的值，得到回歸方程。

圖1 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein concentration

1.3.4 MTT 檢測(cè)巨噬細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞加入5 mg/mL 的MTT，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸去上清，加入200 μL DMSO 以溶解細(xì)胞形成的紫色結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在波長(zhǎng)490 nm 處OD 值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 巨噬細(xì)胞活性成分的測(cè)定

1） 糖原的測(cè)定 蒸餾水清洗→高碘酸溶液氧化→雪夫試劑染色→蘇木素復(fù)染→自來(lái)水返藍(lán)→脫水、封片、鏡檢。

2） DNA 及RNA 的測(cè)定 爬片4%多聚甲醛固定→吖啶橙染色→抗熒光淬滅劑封片→鏡檢。

3） 酸性ATP 酶（ATPase）的測(cè)定方法 ATPase 活性檢測(cè)試劑盒法。

4） 溶菌酶LZM 測(cè)定 溶菌酶（LZM）檢測(cè)試劑盒法。

5） 超氧化物歧化酶SOD 活力測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）WET-1 法測(cè)定試劑盒法。

1.3.6 細(xì)胞因子的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 測(cè)定細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ 液的含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3 次，取平均值。用Graphpad prism5 進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄及作圖，以±s 表示。采用SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析和Duncan 式進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT 法檢測(cè)巨噬細(xì)胞增殖

以不同濃度MBPs 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞24 h，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)表1。

以不同濃度的MBPs 單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞4 h，加入2 μg/mL 的LPS 處理24 h，巨噬細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 MBPs 添加量對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of MBPs adding amount on macrophage proliferation

表2 MBPs+LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of MBPs+LPS adding amount on macrophage proliferation

由表1可知，LPS 組的OD490nm顯著 （P＜0.05）低于PBS 空白對(duì)照組，表明LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞具有明顯的抑制作用；10 μg/mL 的低濃度MPBs 試驗(yàn)組對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖率和PBS 空白對(duì)照組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；而隨著MPBs 的濃度增加，MPBs對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用顯著提高（P＜0.05），并呈濃度依賴性。這說(shuō)明MPBs 對(duì)巨噬細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。MBPs+LPS 對(duì)細(xì)胞增殖的影響試驗(yàn)表明：當(dāng)MBPs 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 和50 μg/mL 時(shí)，不能顯著降低LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞的抑制作用；而隨著MPBs 的濃度升高時(shí)，顯著降低了LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞的抑制作用。LPS 作為一種細(xì)胞毒素，對(duì)巨噬細(xì)胞具有一定的激活作用，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO 和釋放細(xì)胞免疫因子等生物活性物質(zhì)，適量的免疫因子可提高機(jī)體抵抗外界刺激和修復(fù)機(jī)體損傷的作用，而過(guò)量持續(xù)的刺激產(chǎn)生的免疫活性物質(zhì)則會(huì)引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和凋亡[15]。陽(yáng)性對(duì)照組的LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著（P＜0.05）的抑制作用。當(dāng)以質(zhì)量濃度高于100 μg/mL MPBs 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞時(shí)，顯著降低LPS 對(duì)增殖的抑制作用。這說(shuō)明MPBs 能在一定程度上對(duì)巨噬細(xì)胞起保護(hù)功能，降低了LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞的強(qiáng)烈刺激及提升了巨噬細(xì)胞對(duì)外界刺激的耐受能力，從而提高了增殖率。其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

2.2 MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞糖原和核酸的影響

2.2.1 MBPs 對(duì)糖原的影響 以不同濃度的MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)后，采取PAS 法染色，在放大倍數(shù)為200 倍的顯微鏡下使用DP73 成像，采集到的染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)糖原的影響Fig.2 Effect of different concentrations MBPs on glycogen in macrophages

糖原是細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)藏能量的多糖類(lèi)物質(zhì)，糖原增多，在一定程度上體現(xiàn)巨噬細(xì)胞經(jīng)刺激后的巨噬細(xì)胞活力和代謝能力的增加。由圖2可知，巨噬細(xì)胞受LPS 和高濃度的MPBs 刺激后，細(xì)胞內(nèi)紫色顆粒顏色加深，塊狀聚團(tuán)程度增加，胞內(nèi)糖原顆粒增加。低濃度MPBs 組與空白對(duì)照組相比差異不明顯，說(shuō)明低濃度的MPBs 對(duì)巨噬細(xì)胞的糖原代謝影響較小。這和不同濃度的MPBs 對(duì)巨噬細(xì)胞增殖能力的影響一致。

2.2.2 MBPs 對(duì)核酸的影響 以不同濃度的MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)后的吖啶橙染色，在熒光顯微鏡下放大400 倍，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度的MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)核酸的影響Fig 3 Different concentrations of MBPs for nucleic acid in macrophages

圖3中，淡綠色熒光為核內(nèi)DNA 染色效果，橘紅色熒光為胞質(zhì)內(nèi)RNA 染色效果。隨著MBPs的濃度增大，細(xì)胞核內(nèi)的DNA 和RNA 染色程度均逐漸增加，并顯著高于空白對(duì)照組及LPS 陽(yáng)性對(duì)照組。DNA 是細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。RNA 是遺傳信息的載體，主要有3 種，即：信使核苷酸mRNA、轉(zhuǎn)運(yùn)核苷酸t(yī)RNA 和核糖體核苷酸rRNA，主要功能為實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá)，而蛋白質(zhì)是機(jī)體免疫防御功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著MPBs 濃度的升高，RNA 表達(dá)量升高，細(xì)胞內(nèi)的核酸代謝能力增強(qiáng)，為蛋白質(zhì)的合成提取前期物質(zhì)基礎(chǔ)，使巨噬細(xì)胞的活性在基因表達(dá)水平上有了一定的提升。

2.2.3 MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞中ATPase 的影響 MBPs單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞中ATPase 的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。以MBPs+LPS 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，對(duì)ATPase 的影響見(jiàn)圖5。

圖4 MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞中ATPase 活性的影響Fig.4 Effect of MBPs on ATPase activity in macrophages

圖5 MBPs+LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞中ATPase 活性的影響Fig.5 Effect of MBPs+LPS on ATPase activity in macrophages

ATPase 存在于線粒體內(nèi)膜，是一種能夠水解ATP，并利用ATP 水解釋放出的能量，驅(qū)動(dòng)物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)倪\(yùn)輸?shù)鞍?。ATPase 酶的活性直接影響巨噬細(xì)胞的增殖及免疫活性。由圖4可知，LPS 具有顯著抑制ATPase 酶活力的作用[16]。以不同濃度MBPs 培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中ATPase 的活力增加，且較陽(yáng)性對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。由圖5可知，以不同濃度MBPs 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞后用LPS 刺激與單獨(dú)LPS 刺激作對(duì)比，發(fā)現(xiàn)MBPs 可以顯著降低LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞ATPase 活力的抑制作用，并與濃度呈正相關(guān)。這和之前的試驗(yàn)MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞糖原的作用結(jié)果一致。

2.2.4 MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞LZM 和SOD 活力的影響

2.2.4.1 對(duì)LZM 活力的影響 用MBPs 單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)LZM 含量的影響見(jiàn)圖6。以MBPs+LPS 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，對(duì)LZM 含量的影響見(jiàn)圖7。

溶菌酶（LZM）是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶[17]，主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4 糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出，使細(xì)菌溶解，從而具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗腫瘤等廣泛的藥理作用。由圖7、圖8可知，LPS 顯著抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)LZM 含量。MPBs 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)LZM 的含量有一定促進(jìn)作用，并隨著濃度的升高，促進(jìn)作用增強(qiáng)，當(dāng)MPBs質(zhì)量濃度超過(guò)50 μg/mL 時(shí)，巨噬細(xì)胞內(nèi)的LZM含量較對(duì)照組顯著提高。此外，MPBs 還可在一定程度上降低LPS 對(duì)LZM 的抑制作用，減弱LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞的過(guò)度刺激，并且MPBs 濃度越高，效應(yīng)越顯著，當(dāng)MPBs 的質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL 時(shí)，LZM 含量和正常組基本相當(dāng)且差異不顯著。MPBs具有提高巨噬細(xì)胞LZM 含量的作用。

2.2.4.2 對(duì)SOD 活力的影響 MBPs 單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD 活力的影響見(jiàn)圖8。以MBPs+LPS 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，對(duì)SOD 活力的影響見(jiàn)圖9。

圖6 MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)LZM 含量的影響Fig.6 Effect of MBPs on LZM content in macrophage

圖7 MBPs+LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)LZM 含量的影響Fig.7 Effect of MBPs+LPS on LZM content in macrophage

圖8 MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞SOD 活力的影響Fig.8 Effect of MBPs on SOD macrophages SOD vitality

圖9 MBPs+LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞SOD 活力的影響Fig.9 Effect of MBPs+LPS on macrophages SOD vitality

超氧化物歧化酶（SOD）是一種廣泛存在于生命體內(nèi)，具有抗氧化作用的活性酶，可將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，進(jìn)而被分解，具有重要的生理意義[18]。由圖8、圖9可知，LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD 活力具有顯著（P＜0.05）抑制作用。MBPs在低質(zhì)量濃度（10 μg/mL）時(shí)，沒(méi)有促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD 的活性；50 μg/mL MBPs 時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD 活性作用效果不顯著（P＞0.05）；而MBPs 質(zhì)量濃度為100 μg/mL 以上時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞中SOD活力有顯著（P＜0.05）的促進(jìn)作用；MBPs 可以降低LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞SOD 活性的抑制，且MPBs 濃度越高，效應(yīng)越顯著。MPBs 具有提高巨噬細(xì)胞SOD 活力的作用，能緩解LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞SOD 活力的抑制作用。

2.2.5 MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞因子分泌的影響 用MBPs 單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞因子含量的影響見(jiàn)表3。以MBPs+LPS 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞因子含量的影響見(jiàn)表4。

細(xì)胞因子是指一類(lèi)由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性多功能多肽或蛋白質(zhì)分子，可以調(diào)節(jié)全身的免疫應(yīng)答反應(yīng)。細(xì)胞因子不僅具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤等多方面的作用，還可介導(dǎo)發(fā)生病理性作用，導(dǎo)致某些病理過(guò)程的發(fā)生。IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ 是細(xì)胞因子中重要的促炎性因子[19]。由表3可知，MPBs 可顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1α、TNF-α、IFNγ 的表達(dá)，在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞因子的分泌能力也具有顯著（P＜0.05）的促進(jìn)作用。由表4可知，與LPS 陽(yáng)性對(duì)照組相比，MBPs 可以顯著（P＜0.05）下調(diào)促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ 的表達(dá)，并且MPBs 濃度越高，效應(yīng)越顯著。MPBs 具有上調(diào)巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的分泌，并能下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎性因子的分泌。

表3 MBPs 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ）的影響（pg/mL）Table 3 Effect of MBPs on cytokines （IL-6，IL-1α、TNF-α and IFN-γ） levels in macrophage（pg/mL）

表4 MBPs+LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（IL-6、IL-1α、TNF-α、IFN-γ）的影響（pg/mL）Table 4 Effect of MBPs + LPS on cytokines （IL-6，IL-1α，TNF-α and IFN-γ） levels in macrophage（pg/mL）

3 討論

巨噬細(xì)胞屬于免疫細(xì)胞，是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)的高度成熟、分化的一種類(lèi)型。其具有多方面的生物功能，主要包括非特異性免疫防御，清除外來(lái)細(xì)胞，非特異性免疫監(jiān)視，呈遞抗原，分泌干擾素及補(bǔ)體等，在機(jī)體的免疫應(yīng)答方面具有重要的作用。而MPBs 是由綠豆蛋白水解得到的高生物活性成分。有研究表明綠豆蛋白肽具有提高免疫力的活性，具有免疫調(diào)節(jié)作用[6，20]。本試驗(yàn)主要研究其對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。

MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖和細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)具有較明顯的促進(jìn)作用，表明MBPs 通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，活化巨噬細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮免疫作用。另一方面，LPS 作為一種細(xì)胞內(nèi)毒素，在低濃度時(shí)可以激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)免疫；而較高濃度的刺激可對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生副作用，抑制巨噬細(xì)胞的增殖。MBPs 對(duì)LPS 的這種抑制有抵制作用，起到保護(hù)巨噬細(xì)胞的作用。然而，MBPs是如何誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫激活和調(diào)節(jié)的機(jī)理尚不清楚。由試驗(yàn)可知，MPBs 對(duì)巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)RNA 具有表達(dá)量上調(diào)作用，并對(duì)細(xì)胞因子具有雙向調(diào)節(jié)作用，而關(guān)于MBPs 是如何通過(guò)受體信號(hào)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的，還需進(jìn)一步的研究。MBPs促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞活性，抑制LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞的損害，說(shuō)明其對(duì)巨噬細(xì)胞具有增強(qiáng)其活力及免疫能力的作用，而對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性。今后可進(jìn)行巨噬細(xì)胞培養(yǎng)的體外試驗(yàn)，以探究其它免疫作用。

4 結(jié)論

研究MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞增殖、糖原、核酸、ATPase、LZM、SOD 及細(xì)胞因子的影響。研究發(fā)現(xiàn)：在設(shè)計(jì)濃度范圍，MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)毒副作用，并具有一定的促進(jìn)作用；低濃度MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞糖原影響較小，而高濃度MBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)糖原影響較大；隨著MBPs 濃度增高，核內(nèi)DNA 及胞質(zhì)內(nèi)RNA 的染色程度逐漸增加，細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng)；當(dāng)MBPs 質(zhì)量濃度為100 μg/mL 和200 μg/mL 時(shí)，ATPase 活力較空白組差異顯著，MBPs 可緩解LPS 對(duì)ATPase 活性的抑制，此作用顯著，且與濃度正相關(guān)；MBPs 質(zhì)量濃度大于50 μg/mL 時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)LZM 的含量呈顯著的促進(jìn)作用，可以緩解LPS 對(duì)LZM 含量的降低作用，此種作用與MBPs 濃度正相關(guān)；MBPs 質(zhì)量濃度在100 μg/mL以上，對(duì)巨噬細(xì)胞酶內(nèi)SOD 活性和緩解LPS 的刺激作用有顯著的效果；MPBs 可以上調(diào)巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并可下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎性因子的分泌，從而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的作用。MBPs 影響巨噬細(xì)胞免疫活性的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。