Hepcidin對人非小細(xì)胞肺癌H520細(xì)胞生長的影響研究①

李 捷 李艷穎 焦江琴 李付廣

(河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)免疫實驗室，洛陽 471000)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[1]。鐵是所有生命細(xì)胞基本活動所必需，多種腫瘤發(fā)生發(fā)展可增加鐵的需求量，因此鐵被認(rèn)為是維持腫瘤細(xì)胞生長和發(fā)展的基本物質(zhì)[2]。已有研究表明，調(diào)節(jié)腫瘤鐵代謝可影響其生長，降低胞內(nèi)鐵利用可作為治療腫瘤的一個途徑[3]。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)鐵維持在一個穩(wěn)定的生理水平，即鐵穩(wěn)定。目前已發(fā)現(xiàn)，鐵調(diào)素(Hepcidin)、膜鐵轉(zhuǎn)(Ferroportin)等多個蛋白參與鐵轉(zhuǎn)運[4，5]。Hepcidin是一類小分子多肽，主要由肝臟合成分泌，在機(jī)體鐵代謝平衡中起重要作用，有研究表明，Hepcidin可通過調(diào)節(jié)其細(xì)胞膜上受體Ferroportin，轉(zhuǎn)運細(xì)胞內(nèi)游離鐵至胞外，F(xiàn)erroportin的低表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生額外的胞內(nèi)游離鐵，使得腫瘤細(xì)胞更具侵襲性，異常表達(dá)的Hepcidin引起的鐵代謝失衡是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[6]。最近研究表明，F(xiàn)erroportin在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，恢復(fù)Ferroportin在乳腺癌細(xì)胞表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞生長[7]。Hepcidin在非小細(xì)胞肺癌組織表達(dá)升高，抑制Hepcidin表達(dá)可降低肺癌細(xì)胞增殖能力[8]。本文旨在研究Hepcidin表達(dá)對肺癌H520細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 人非小細(xì)胞肺癌H520細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素及FBS均購自美國Gibco；CCK8試劑購自日本DOJINDO；凋亡試劑盒購自江蘇凱基；Hepcidin試劑及Ferroportin抗體均購自美國Sigma；Hepcidin及GAPDH抗體均購自美國CST；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman-Coulter；酶標(biāo)儀購自美國ThermoFisher。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) H520細(xì)胞在含有10%FBS及100 U/ml的青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2siRNA設(shè)計合成及轉(zhuǎn)染 特異性干擾Hepcidin表達(dá)的siRNA及陰性對照siRNA均由上海吉瑪公司設(shè)計并合成，分別命名為si-Hepcidin及si-Scrabble，序列如下：si-Hepcidin：sense 5′-ACAACAGACGGGACAACUUTT-3′，anti-sense 5′-AAGUUGUCCCGUCUGUUGUTT-3′；si-Scrabble：sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，anti-sense 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。實驗分組：對照組、si-Scrabble組和si-Hepcidin組。轉(zhuǎn)染前1 d接種H520細(xì)胞于6孔板，細(xì)胞達(dá)70%～80%生長融合時，參照LipofectamineTM2000說明制備siRNA-Lip2000復(fù)合物，將復(fù)合物加入6孔板，對照組加入脂質(zhì)體，于培養(yǎng)箱內(nèi)溫育4～6 h，吸棄轉(zhuǎn)染液，加含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。按照實驗設(shè)計的孵育時間收獲細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3Western blot 提取轉(zhuǎn)染siRNA 的H520細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。50 μg/孔蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜，加適量稀釋的一抗(1∶500稀釋Hepcidin和Ferroportin抗體)，4℃孵育過夜，洗膜，加HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，洗膜，ECL顯影。GAPDH作為內(nèi)參基因，Image-J軟件分析條帶灰度值。以Hepcidin與GAPDH蛋白條帶灰度值比值作為Hepcidin的蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.2.4轉(zhuǎn)染si-Hepcidin后的細(xì)胞活力變化 取生長至對數(shù)期的H520細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為3×104個/ml，每孔100 μl(約3 000個細(xì)胞)接種于96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育24 h，按照上述分組轉(zhuǎn)染siRNA，于轉(zhuǎn)染的24 h、48 h、72 h和96 h，每孔加CCK8試劑10 μl，培養(yǎng)箱常規(guī)孵育 2 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長測定各孔吸光度值(A值)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5轉(zhuǎn)染si-Hepcidin后的細(xì)胞凋亡率變化 si-Hepcidin干擾H520細(xì)胞72 h，收集96孔板中的細(xì)胞，離心，倒掉上清液，PBS洗滌沉淀細(xì)胞，離心，棄掉上清，500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC及PI各5 μl，混勻，室溫、避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.2.6H520細(xì)胞及轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞胞內(nèi)鐵含量檢測 胰酶消化轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106ml-1，取1 ml細(xì)胞懸液，每毫升細(xì)胞懸液加CA-AM 0.25 nmol/L，于37℃條件下孵育5 min，緩沖液洗滌細(xì)胞(含20 mmol/L Hepes及1 mg/ml BSA)，除去多余CA-AM，HBSS緩沖液重懸細(xì)胞，取1 ml使用酶標(biāo)儀測定熒光值(A)，細(xì)胞懸液中加100 mmol/L鐵螯合劑BIP，37℃孵育30 min，HBSS緩沖液洗滌及重懸細(xì)胞后，酶標(biāo)儀測定熒光值(B)。實驗重復(fù)3次。

1.2.7加入Hepcidin對轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞活力的影響 取生長至對數(shù)期的si-Hepcidin H520細(xì)胞，胰酶消化，離心，制備成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整終濃度為1.25×105ml-1，分為兩組：Hepcidin+組(加500 mol/L的外源性Hepcidin)和Hepcidin-組(不加Hepcidin)，接種單細(xì)胞懸液于6孔板，常規(guī)孵育24 h，胰酶消化細(xì)胞，接種單細(xì)胞懸液(1×105ml-1)于96孔板，每孔100 μl，每組5個復(fù)孔，常規(guī)孵育24 h、48 h、72 h和96 h，按照1.2.4方法檢測吸光度值(A值)。實驗重復(fù)3次。

1.2.8加入Hepcidin對轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞凋亡的影響 分組同1.2.7，細(xì)胞凋亡率檢測參照1.2.5。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞Hepcidin蛋白表達(dá) 如圖1和表1所示，轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞Hepcidin蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染si-Scrabble的H520細(xì)胞Hepcidin蛋白表達(dá)與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染si-Hepcidin抑制H520細(xì)胞活力 CCK8檢測si-Hepcidin轉(zhuǎn)染后的H520細(xì)胞活力，結(jié)果如表2所示，si-Hepcidin轉(zhuǎn)染H520細(xì)胞72 h和96 h的細(xì)胞活力均明顯低于對照組(P<0.05)。

2.3轉(zhuǎn)染si-Hepcidin促進(jìn)H520細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖2和表3所示，si-Hepcidin組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)。

表1 轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞Hepcidin蛋白表達(dá)

Tab.1 Expression of Hepcidin protein in H520 cells transfected with si-Hepcidin

GroupsRelative expression of Hepcidin proteinControl group0.306±0.032si-Scrabble group0.321±0.036si-Hepcidin group0.085±0.0101)F64.935P0.000

Note：1)P<0.05 vs Control group

表2 轉(zhuǎn)染si-Hepcidin對H520細(xì)胞活力的影響

Tab.2 Effect of si-Hepcidin transfection on activity of H520 cells

Groups24 h48 h72 h96 hControl group0.082±0.0100.257±0.0310.692±0.0580.987±0.071si-Scrabble group0.079±0.0110.242±0.0290.681±0.0560.963±0.067si-Hepcidin group0.071±0.0080.212±0.0250.391±0.0421)0.642±0.0621)F1.0211.94731.73224.971P0.4150.2230.0010.001

Note：1)P<0.05 vs Control group

圖2 轉(zhuǎn)染si-Hepcidin對H520細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of si-Hepcidin transfection on apoptosis of H520 cells

2.4轉(zhuǎn)染si-Hepcidin上調(diào)H520細(xì)胞Ferroportin表達(dá) 如圖3和表4所示，F(xiàn)erroportin在si-Hepcidin組的蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)。

2.5轉(zhuǎn)染si-Hepcidin降低H520細(xì)胞胞內(nèi)鐵含量 采用免疫熒光法測定各組細(xì)胞胞內(nèi)鐵含量，結(jié)果如表5所示，si-Hepcidin組胞內(nèi)鐵含量明顯低于對照組(P<0.05)。

2.6加入Hepcidin可減弱si-Hepcidin對H520細(xì)胞活力抑制 如表6所示，加入外源性Hepcidin，si-Hepcidin細(xì)胞在72 h和96 h的細(xì)胞活力均明顯升高，與未加Hepcidin比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 轉(zhuǎn)染si-Hepcidin對H520細(xì)胞凋亡的影響

Tab.3 Effect of si-Hepcidin transfection on apoptosis of H520 cells

GroupsApoptosis rate (%)Control group2.64±0.28si-Scrabble group2.53±0.25si-Hepcidin group15.43±1.521)F201.938P0.000

Note：1)P<0.05 vs Control group.

圖3 轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞中Ferroportin蛋白表達(dá)Fig.3 Ferroportin protein epxression in H520 cells transfected with si-Hepcidin

表4 轉(zhuǎn)染si-Hepcidin對H520細(xì)胞Ferroportin表達(dá)的影響

Tab.4 Effect of si-Hepcidin transfection on Ferroportin expression in H520 cells

GroupsExpression of Ferroportin proteinControl group0.089±0.010si-Scrabble group0.096±0.011si-Hepcidin group0.461±0.0481)F161.381P0.000

Note：1)P<0.05 vs Control group.

表5 轉(zhuǎn)染si-Hepcidin對H520細(xì)胞胞內(nèi)鐵含量的影響

Tab.5 Effect of si-Hepcidin transfection on intracellular iron content in H520 cells

GroupsIntracellular iron contentControl group0.41±0.10si-Scrabble group0.38±0.08si-Hepcidin group0.12±0.041)F12.717P0.007

Note：1)P<0.05 vs Control group.

表6 Hepcidin可減弱si-Hepcidin對H520細(xì)胞活力的影響

Tab.6 Hepcidin attenuate effect of si-Hepcidin on H520 cell viability

Groups24 h48 h72 h96 hHepcidin- group0.082±0.0130.268±0.0310.654±0.0520.944±0.061Hepcidin+ group0.091±0.0150.277±0.0340.819±0.0651)1.112±0.0741)t0.7850.3393.4333.034P0.4760.7520.0270.039

Note：1)P<0.05 vs-Hepcidin group.

圖4 Hepcidin可減弱si-Hepcidin對H520細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Hepcidin attenuate the effect of si-Hepcidin on apoptosis of H520 cells

2.7加入Hepcidin可減弱si-Hepcidin對H520細(xì)胞凋亡誘導(dǎo) 如圖4所示，加入外源性Hepcidin，si-Hepcidin細(xì)胞的凋亡率(7.54±0.51)%明顯降低，與未加Hepcidin比較(19.41±0.75)%差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 )。

3 討論

鐵作為細(xì)胞色素、血紅蛋白、氧化還原的必要組分，廣泛參與能量代謝、DNA合成和表達(dá)、氧氣輸送及細(xì)胞周期調(diào)控[9,10]。Hepcidin又稱為肝臟特異表達(dá)抗菌肽，可通過與Ferroportin 1結(jié)合，使Ferroportin 1發(fā)生磷酸化，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運，胞內(nèi)鐵富集可影響細(xì)胞生長。有研究表明，對鐵代謝相關(guān)的蛋白調(diào)節(jié)可影響腫瘤生長，降低胞內(nèi)鐵利用，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤目的[11]。已有研究顯示沉默Hepcidin表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌H520細(xì)胞增殖[8]，本研究旨在研究沉默Hepcidin表達(dá)對H520細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制。

RNA干擾(RNAi)是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的自然現(xiàn)象，是由雙鏈RNA介導(dǎo)的在轉(zhuǎn)錄后沉默基因表達(dá)的一項新技術(shù)，目前在腫瘤治療、基因功能研究等方面有廣泛應(yīng)用[12-14]。本研究通過RNAi技術(shù)抑制H520細(xì)胞Hepcidin表達(dá)，可發(fā)現(xiàn)Hepcidin表達(dá)明顯降低，表明H520細(xì)胞中Hepcidin表達(dá)受到抑制，這與前人研究結(jié)果一致。凋亡是細(xì)胞對病理性刺激、環(huán)境條件變化等產(chǎn)生的應(yīng)答有序的死亡過程，是細(xì)胞的一種基本特征，在機(jī)體組織功能恢復(fù)、胚胎生長、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用[15]。為了明確Hepcidin對肺癌細(xì)胞凋亡的影響，通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測沉默Hepcidin表達(dá)后的H520細(xì)胞凋亡率變化，結(jié)果顯示，Hepcidin表達(dá)受到抑制后的細(xì)胞凋亡率明顯升高。有研究顯示，RNAi下調(diào)乳腺癌細(xì)胞Hepcidin表達(dá)，能顯著降低細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。本研究也證實了同樣的結(jié)論，提示Hepcidin對肺癌細(xì)胞同樣有促凋亡作用。

人Ferroportin基因定位于2q32染色體，是Hepcidin發(fā)揮鐵代謝調(diào)節(jié)的受體分子，在肝臟、腎臟、脾臟等組織中有廣泛的分布，有研究報道，F(xiàn)erroportin在乳腺癌中表達(dá)降低，可作為腫瘤診斷、預(yù)后及治療的新靶向分子[17,18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默Hepcidin表達(dá)后Ferroportin表達(dá)增加，胞內(nèi)鐵含量降低。說明在肺癌細(xì)胞中Hepcidin通過與Ferroportin結(jié)合形成復(fù)合物，誘導(dǎo)Ferroportin內(nèi)化，并在腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)降低，從而降低Ferroportin在細(xì)胞膜上表達(dá)量，阻斷鐵輸出，通過代謝途徑影響細(xì)胞內(nèi)鐵含量，進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞功能[19]。此外，本研究對轉(zhuǎn)染si-Hepcidin的H520細(xì)胞加外源性Hepcidin，觀察細(xì)胞活力及凋亡率變化，發(fā)現(xiàn)加入外源性Hepcidin可減弱si-Hepcidin對H520細(xì)胞活力抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。提示高表達(dá)Hepcidin可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和抑制凋亡，而抑制Hepcidin表達(dá)可通過鐵代謝抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，高表達(dá)Hepcidin可促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長，抑制Hepcidin表達(dá)可通過調(diào)控肺癌細(xì)胞鐵代謝降低細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究提示Hepcidin可能是腫瘤治療的一個新靶點，為腫瘤治療提供了新的研究思路及理論基礎(chǔ)。