間充質(zhì)干細(xì)胞治療非酒精性脂肪性肝炎的機(jī)制及進(jìn)展

唐振霆，施曉雷，2

（1.南京醫(yī)科大學(xué) 鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210005；2.南京鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210008）

1 非酒精性脂肪肝炎及治療現(xiàn)狀

非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是一種除酒精外由其他各種因素導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積和肝小葉內(nèi)炎癥為特征的臨床病理綜合征[1]，由非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver，NAFLD）進(jìn)展而來(lái)，并可發(fā)展成肝硬化甚至肝癌。原發(fā)性NASH主要由肥胖、高脂血癥、糖尿病、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和代謝綜合征（metabolic syndrome）等因素?fù)p傷肝臟導(dǎo)致的病理學(xué)改變；繼發(fā)性非酒精性脂肪肝則由病毒性肝炎、藥物等因素引起。目前NASH的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在我國(guó)是僅次于病毒性肝炎的慢性肝病，對(duì)國(guó)民健康和社會(huì)發(fā)展構(gòu)成威脅。NASH是一種多系統(tǒng)受累的多發(fā)性疾病，與糖尿病和代謝綜合征相互影響。目前NASH的治療方式僅為控制癥狀的改變不良的生活方式、藥物治療以及減肥手術(shù)，但這些手段都難以逆轉(zhuǎn)NASH以及肝纖維化。

目前細(xì)胞移植治療肥胖引起的代謝性疾病成為研究熱點(diǎn)，其中間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其來(lái)源廣、增殖快成為重點(diǎn)研究的干細(xì)胞。一項(xiàng)系統(tǒng)性的回顧性研究認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞治療肥胖相關(guān)的代謝性疾病很有前景[2]，而且多數(shù)研究認(rèn)為MSCs通過(guò)抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等發(fā)揮治療功能。因此，本文針對(duì)MSCs治療NASH及其相關(guān)代謝性疾病的可能機(jī)制及MSCs的優(yōu)化方案做一介紹。

2 MSCs治療非酒精性脂肪性肝炎的機(jī)制

2.1 胰島素增敏/胰島功能

胰島素抵抗與肝臟脂質(zhì)聚積之間存在密切關(guān)聯(lián)。胰島素對(duì)肝臟糖異生和脂肪從頭合成起著重要作用。胰島素通過(guò)抑制肝臟糖異生維持血糖平衡，胰島素抵抗的發(fā)生則失去了這一作用[3]，進(jìn)一步促進(jìn)胰腺分泌胰島素以維持血糖水平。研究表明，胰島素抵抗選擇性涉及葡萄糖代謝途徑，因此持續(xù)增加的胰島素水平過(guò)度刺激脂肪從頭合成，導(dǎo)致脂質(zhì)生成增加[4]。Cao等[5]在使用MSCs治療高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖癥引起的胰島功能損害中發(fā)現(xiàn)，MSCs可以減少炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、小鼠含生長(zhǎng)因子樣模體粘液樣激素樣受體（F4/80）的表達(dá)，恢復(fù)肝臟胰島素受體（InsR）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達(dá)，抑制胰腺炎癥，進(jìn)而保護(hù)胰島β細(xì)胞群。因此MSCs通過(guò)影響胰島素敏感性發(fā)揮保護(hù)作用可能是潛在的治療機(jī)制。MSCs治療1型糖尿病的臨床研究發(fā)現(xiàn)，MSCs單次注射能保護(hù)和維持胰島β細(xì)胞的殘存功能[6]。另外，MSCs通過(guò)分化成胰島素生成細(xì)胞緩解2型糖尿病[7]。還有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠遷移到包括胰島在內(nèi)的損傷區(qū)域，降低胰島細(xì)胞的凋亡[8-10]。Si等[9]發(fā)現(xiàn)，在使用MSCs治療高脂飲食或鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的2型糖尿病中，MSCs能夠提高周圍靶組織的胰島素敏感性，早期使用MSCs還能促進(jìn)β細(xì)胞功能。在胰島素抵抗的分子機(jī)制中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）從細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜被認(rèn)為是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最后一步，GLUT4數(shù)量的減少和轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜的減少與胰島素抵抗有關(guān)[10]。MSCs可以恢復(fù)GLUT4數(shù)量并促進(jìn)其遷移至細(xì)胞膜，改善胰島素抵抗。綜上，MSC在NASH中可能通過(guò)保護(hù)胰島功能和改善胰島素敏感性而發(fā)揮治療作用（見(jiàn)圖1）。

圖1 MSCs治療NASH及其代謝綜合征的機(jī)制

2.2 調(diào)控脂質(zhì)代謝

關(guān)于NASH的病理變化，“二重打擊”是目前普遍接受的假說(shuō)。“第一重打擊”始于肝內(nèi)游離脂肪酸的堆積導(dǎo)致肝脂肪變，使得肝臟更易遭受“第二重打擊”，包括氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和炎癥，最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[11]。

MSCs調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝是其發(fā)揮保護(hù)肝功能的重要機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，MSCs移植后肝臟脂質(zhì)代謝的相關(guān)指標(biāo)有所改善。Liao等[12]的研究表明，MSCs移植入NASH大鼠體內(nèi)后，血清脂肪酸（FA）、總膽固醇（TG）和甘油三酯（TC）相對(duì)于平衡鹽溶液治療組出現(xiàn)下降。Ezquer等[13]發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FAT/CD36）和脂肪酸合成酶（FAS）水平顯著增加，乙酰輔酶A氧化酶（ACO）和細(xì)胞色素酶CYP2E1水平減少，而經(jīng)過(guò)MSCs治療的肥胖小鼠肝臟內(nèi)脂肪酸氧化相關(guān)酶沒(méi)有被損壞，原因是通過(guò)改變主要代謝組織中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）亞群的表達(dá)降低了肝臟的脂質(zhì)堆積[14]。脂肪和骨骼肌中PPARα和PPARγ與β氧化和脂肪酸攝取有關(guān)，進(jìn)而減少脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟[15-16]。Winkler等[17]在MSCs治療NASH的研究中發(fā)現(xiàn)，低水平的微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并沒(méi)有得到糾正，推測(cè)肝臟TC可以為MSCs介導(dǎo)的肝再生提供主要能量來(lái)源。有研究也證實(shí)了微小的脂肪變性可以促進(jìn)部分肝臟切除后的肝再生[18]。因此，MSCs可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝使肝臟功能得到改善。

2.3 調(diào)控糖代謝

既往大多數(shù)對(duì)MSCs治療脂肪肝的機(jī)制研究主要集中在胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝，目前已有研究顯示MSCs也參與調(diào)控葡萄糖代謝。Xie等[19]在使用MSCs治療2型糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs可以刺激肝臟腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）途徑磷酸化，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，降低血糖濃度，進(jìn)而恢復(fù)2型糖尿病的肝糖代謝。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）[20]是普遍存在于哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與肝糖的合成代謝，通過(guò)抑制糖原合成酶的活性降低肝糖合成，升高血糖濃度，是肝糖代謝的關(guān)鍵酶。Park等[21]發(fā)現(xiàn)，在使用MSCs分泌的細(xì)胞外囊泡治療缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷中，MSCs通過(guò)分泌的細(xì)胞外囊泡中miRNA-26a減少了GSK3β的表達(dá)，緩解了缺血再灌注損傷，從而起到保護(hù)作用。Ding等[22]在MSCs治療肝功能衰竭的研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs通過(guò)抑制GSK3β促進(jìn)糖原合成從而提高90%部分肝切除術(shù)后大鼠的存活率。然而目前MSCs調(diào)控糖代謝中關(guān)鍵酶的機(jī)制研究尚不多，可能成為未來(lái)研究的熱點(diǎn)。

2.4 旁分泌作用

目前研究普遍認(rèn)為分泌可溶性因子是MSCs發(fā)揮療效的主要機(jī)制之一。持續(xù)并過(guò)量的脂質(zhì)堆積造成的脂毒性會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。MSCs分泌的細(xì)胞因子（IL-6）在肝再生過(guò)程中可以上調(diào)抗凋亡因子（Bcl-2、Bcl-xL）的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡[23]。同時(shí)，MSCs能夠分泌前列腺素E，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖[24]。此外，MSCs分泌的細(xì)胞因子（VEGF、bFGF、HGF、EGF）對(duì)肝細(xì)胞有促進(jìn)血管形成的作用，促進(jìn)肝臟再生[25-26]。除了抗凋亡作用，MSCs旁分泌還有抑制炎癥的作用，細(xì)胞外囊泡包括微泡和外泌體在細(xì)胞抗炎修復(fù)中起到重要作用。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)，MSCs分泌的外泌體可以抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥小體（NLRP3）的激活，進(jìn)而對(duì)肝臟炎癥起到緩解作用。此外，MSCs來(lái)源的外泌體通過(guò)緩解氧化應(yīng)激減輕肝臟缺血再灌注損傷[28]。MSCs的培養(yǎng)上清中可以檢測(cè)到超過(guò)150種蛋白質(zhì)，其中大部分是生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子[29]，針對(duì)MSC旁分泌因子的作用機(jī)制仍值得深入探究。

2.5 抗纖維化

NAFLD是世界上最常見(jiàn)的慢性肝病之一[30]。肝纖維化的出現(xiàn)是決定預(yù)后的重要因素，而進(jìn)展至NASH的患者有20%會(huì)發(fā)展成晚期肝纖維化[31]。因此，緩解肝臟纖維化進(jìn)程是MSCs治療NASH的潛在方向之一。

MSCs能緩解肝纖維化的作用主要與抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和活化有關(guān)[32]。研究發(fā)現(xiàn)，使用MSCs治療NASH后，IV型膠原蛋白表達(dá)減少，致纖維因子TGF-β1下調(diào)并且α-SMA+星狀細(xì)胞減少[13，33]。Ezquer等[34]發(fā)現(xiàn)，在使用MSCs治療脂肪肝肝切除導(dǎo)致的損傷中，原先表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、結(jié)蛋白（desmin）和波形蛋白（vimentin）的MSCs一旦注入體內(nèi)后就改變了表型，表現(xiàn)為僅表達(dá)促增殖標(biāo)志物結(jié)蛋白和波形蛋白。Huang等[35]在使用MSC治療TAA誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝功能衰竭中發(fā)現(xiàn)，MSCs通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡或減少激活肝星狀細(xì)胞來(lái)緩解肝臟纖維化。此外，MSCs可以通過(guò)表達(dá)MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)[36-37]。有研究發(fā)現(xiàn)，MSC通過(guò)轉(zhuǎn)換成纖維性疤痕成肌纖維細(xì)胞（fibrous scar-produced myo fibroblasts）加快纖維化的進(jìn)展，另有一些研究則認(rèn)為MSCs對(duì)肝纖維化沒(méi)有作用[38-39]。因此，MSCs對(duì)于肝纖維化的調(diào)控還值得進(jìn)一步研究。

2.6 抗炎和免疫調(diào)節(jié)

炎癥細(xì)胞在NAFLD進(jìn)展至NASH甚至肝細(xì)胞性肝癌的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[40]。Kupffer細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子啟動(dòng)肝臟炎癥反應(yīng)[41]。MSCs可通過(guò)前列腺素E2途徑抑制Kupffer細(xì)胞中炎癥小體的激活[42]，并且可促使Kupffer細(xì)胞由促炎型（M1）向抗炎型（M2）轉(zhuǎn)化，從而減少TNF-α和IL-6的表達(dá)，提高IL-4和IL-10的表達(dá)水平[43]。另外，MSCs可以調(diào)節(jié)自然殺傷T細(xì)胞（NKT cells）和調(diào)節(jié)性自然殺傷T細(xì)胞（NKTregs）的比例來(lái)緩解肝臟損傷[44]。Wang等[45]發(fā)現(xiàn)，MSCs可以抑制高脂飲食導(dǎo)致的CD4+T細(xì)胞的增殖，進(jìn)而緩解脂肪變和炎癥，緩解高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD。MSCs可以調(diào)節(jié)肝纖維化相關(guān)因子，減少IL-17以及產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞，提高IL-10的表達(dá)。此外，MSCs上清還能促進(jìn)分泌IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞增殖并抑制Th17細(xì)胞增殖[46]。MSCs對(duì)自然殺傷細(xì)胞（NK cells）也具有調(diào)節(jié)作用，研究表明MSCs通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)衰老樣NK細(xì)胞表型終止炎癥反應(yīng)，并且NK細(xì)胞的反饋也會(huì)促進(jìn)MSCs增殖和促血管生成特性[47]。因此，MSCs可能通過(guò)對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮對(duì)NASH的治療作用。

3 MSC移植的問(wèn)題與優(yōu)化方案

另一方面，MSCs移植的副作用及安全性也值得重視。MSCs壽命較長(zhǎng)，抗凋亡能力及復(fù)制更新能力有著和腫瘤細(xì)胞類似的特點(diǎn)，因而對(duì)其臨床應(yīng)用有著致瘤性的顧慮。Centeno等[48]對(duì)227例患者使用培養(yǎng)擴(kuò)增的自體來(lái)源MSCs治療骨科疾病，長(zhǎng)期檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)有腫瘤形成。有研究將臍帶來(lái)源的MSCs移植到小鼠皮下后兩個(gè)月未觀察到腫瘤形成[49]。但Miura等[50]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠BMSCs染色體存在不穩(wěn)定性，可能導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。盡管體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MSCs的致瘤現(xiàn)象，但是仍需要進(jìn)一步探究MSCs培養(yǎng)過(guò)程中突變的可能性，完善對(duì)MSCs的功能評(píng)估。

發(fā)熱是MSCs移植后常見(jiàn)的不良反應(yīng)[51-52]。因MSCs具有低免疫原性，MSC移植引起的發(fā)熱與免疫反應(yīng)無(wú)明顯直接關(guān)系，移植患者無(wú)需特別治療可以自然恢復(fù)。

雖然MSCs的基礎(chǔ)研究和臨床研究日益增多，但是MSCs的治療效果仍然有待提高。近年來(lái)，隨著組織工程學(xué)研究的不斷深入，利用材料模擬MSCs培養(yǎng)微環(huán)境取得了新的進(jìn)展[53]。傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)系統(tǒng)較為簡(jiǎn)單，但是可能導(dǎo)致MSCs的生物組織結(jié)構(gòu)和生物信息丟失，影響MSCs的生物功能。三維支架的研究為MSCs的培養(yǎng)提供了新的思路，將干細(xì)胞黏附在具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料使其良好生存并長(zhǎng)期發(fā)揮功能。常用的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架材料分為脫細(xì)胞支架、天然生物材料支架和合成材料支架[54]。脫細(xì)胞支架由于保留了組織的結(jié)構(gòu)是理想的支架之一，但由于天然組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以確保制備過(guò)程中質(zhì)量的穩(wěn)定性[55]。天然生物材料來(lái)源于動(dòng)物或人體，因其低抗原性、可降解受到研究者的關(guān)注，其中膠原凝膠可以使?fàn)I養(yǎng)物自由進(jìn)出，利于細(xì)胞黏附和增殖，是一種有前景的生物材料。Murphy等[56]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變纖維蛋白水凝膠的特性可以促進(jìn)MSCs分泌VEGF和PGE2，從而促進(jìn)傷口愈合。合成材料支架主要有可控性、可塑性等優(yōu)點(diǎn)，主要有聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯和聚碳酸酯等，但是人工合成材料也有親水性差、細(xì)胞黏附性較弱的缺點(diǎn)。因此生物材料對(duì)MSCs培養(yǎng)的優(yōu)化還需要更多的研究。

4 總結(jié)與展望

雖然近幾年MSCs在治療多種疾病的研究中顯示了眾多優(yōu)勢(shì)，但將其廣泛運(yùn)用于臨床還需要進(jìn)一步深入研究。MSCs移植還有一些問(wèn)題需要解決，如MSCs移植的合適時(shí)機(jī)、注射劑量及優(yōu)化培養(yǎng)方案。如何提高M(jìn)SCs在體內(nèi)的存活率、定植率和安全性并發(fā)揮治療作用尚未明確。但MSCs在胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、肝纖維化以及炎癥免疫等方面的調(diào)節(jié)作用為進(jìn)一步研究MSCs移植治療NASH提供了希望。