同卵雙胞胎膽道閉鎖患兒染色體核型和全外顯子組測(cè)序分析

陳 揚(yáng)，余 晨，熊希倩，賈金富，詹江華

（1.天津市兒童醫(yī)院普通外科，天津300134；2.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070）

膽道閉鎖（biliary atresia,BA）是新生兒期嚴(yán)重的、外科梗阻性黃疸的常見原因之一，病因不清，認(rèn)為可能與病毒感染、免疫損傷、遺傳易感性以及環(huán)境因素等有關(guān)。近年，關(guān)于BA遺傳學(xué)背景的研究有很多，主要通過全基因組多態(tài)性分析總結(jié)與BA發(fā)病相關(guān)的位點(diǎn)，包括 ADD3、MIF、GPC1、ICAM-1、IL-8及VCAM1等[1-4]，但目前仍無確鑿的證據(jù)證明某一基因改變與BA的發(fā)生有直接必然的關(guān)系。以雙胞胎為研究對(duì)象，探討環(huán)境因素和遺傳因素在疾病發(fā)病機(jī)制中作用的相關(guān)報(bào)道有很多，包括在Crohn's病、范德沃徳氏綜合征（Van der Woude Syndrome）及多發(fā)性硬化等疾病中均有報(bào)道。單胎發(fā)病的同卵雙胞胎BA患兒，來自同一受精卵、相同的子宮內(nèi)環(huán)境以及相似的生后環(huán)境，其患病情況不同。本實(shí)驗(yàn)以3對(duì)臨床表型不同的同卵雙胞胎BA患兒為研究對(duì)象，分別進(jìn)行染色體G顯帶核型分析和全外顯子組測(cè)序，檢測(cè)該對(duì)雙胎兒是否存在染色體核型異常和差異基因型，初步探討膽道閉鎖發(fā)生的遺傳學(xué)背景。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集3對(duì)同卵雙胞胎BA患兒臨床資料，均為雙胎之一患膽道閉鎖，診斷依據(jù)術(shù)中膽道造影及肝活檢結(jié)果，采集雙胎兒外周靜脈血作為實(shí)驗(yàn)樣本，分別進(jìn)行染色體G顯帶核型分析和全外顯子測(cè)序分析。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 主要試劑：人血液樣本DNA提取試劑盒，無酶水、無水乙醇、秋水仙素、75%甲醇、25%乙酸、0.2%胰酶消化液，均購(gòu)自天根生化科技有限公司。姬姆薩染液，人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，0.075 mol/L的氯化鉀溶液，均購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司。主要儀器：NanoDrop2000分光光度儀（美國(guó)Thermo公司），恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋（德國(guó)IKA公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus）。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 染色體G顯帶染色步驟 （1）取血：用肝素抗凝的采血管分別取雙胞胎外周靜脈血各4 mL；（2）接種、細(xì)胞培養(yǎng)：將外周血液標(biāo)本接種于人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，隨后置于CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h；（3）秋水仙素處理、低滲處理：加入10 μg秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，離心10 min，再與KCl溶液混勻，37 ℃水浴 20 min；（4）預(yù)固定、固定：在離心管中加入甲醇和乙酸固定液，靜置10 min，離心，棄上清液，獲得固定液，將固定液置于新的離心管中，37 ℃水浴 10 min，離心，棄上清液；（5）制片、染色：將固定液置于新的離心管中，在載玻片上滴加2滴細(xì)胞懸液，烘干，取出玻片后先用胰酶消化，再用Giemsa染液染色；（6）顯微鏡下觀察細(xì)胞分裂相，并進(jìn)行染色體核型分析。

1.3.2 全外顯子組測(cè)序?qū)嶒?yàn)步驟 （1）按照DNA提取試劑盒說明書提取血液樣本總DNA；（2）用NanoDrop 2000分光光度儀對(duì)所提DNA樣品濃度和純度進(jìn)行測(cè)定；（3）全外顯子組測(cè)序，將提取合格的血液樣本DNA送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)處理。包括①文庫(kù)的建立；②IlluminaHiSeq上機(jī)測(cè)序；③測(cè)序數(shù)據(jù)的處理；④目標(biāo)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋。分析軟件及數(shù)據(jù)篩選數(shù)據(jù)庫(kù)：（1）原始數(shù)據(jù)定位軟件-BWA（Burrows-Wheeler Aligner）；（2）數(shù)據(jù)校準(zhǔn)-Genome Analysis Toolkit 1.3-22-glbfe280；（3）SNP calling-SAMtools（Sequence Alignment/Map Tools）；（4）dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)（version 135）；（5）千人基因組（1 000 genome）數(shù)據(jù)庫(kù)（version 1 000 g2012apr）。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 Twin1，同卵雙胞胎兒，女性，足月剖宮產(chǎn)，其中之一患膽道閉鎖，另一雙胎兒正常，患兒出生后3 d即出現(xiàn)黃疸，因黃疸持續(xù)未退于生后46 d來我院就診，查體患兒皮膚及鞏膜黃染，蒼白便，茶色尿。肝功能結(jié)果提示梗阻性黃疸。母親乳汁病毒學(xué)檢查CMV-DNA為8×103個(gè)/mL，提示患兒可能有CMV病毒感染。腹部超聲示：膽囊窩未見正常膽囊形態(tài)，僅見裂隙樣囊性結(jié)構(gòu)，約14 mm×3 mm，壁粗糙，較硬，未見明顯粘膜線回聲。膽總管未探及，第一肝門區(qū)可見局限性強(qiáng)回聲區(qū)約12 mm×3.5 mm呈條索狀，肝脾增大（圖1）。術(shù)前未行肝活檢?；純荷?9 d行開腹探查術(shù)，術(shù)中膽道造影和冰凍肝活檢結(jié)果符合肝外膽道梗阻，行Kasai手術(shù)，術(shù)后3個(gè)月患兒黃疸完全消退，大小便恢復(fù)正常顏色，術(shù)后恢復(fù)良好。隨訪期間患兒共發(fā)生2次晚期膽管炎，入院治療1周后好轉(zhuǎn)出院。隨訪3年患兒未發(fā)生其他嚴(yán)重的并發(fā)癥。

圖1 彩色Doppler超聲檢查結(jié)果Fig 1 The results of Color Doppler ultrasound

其余兩對(duì)雙胎皆為男性，同卵雙胞胎，其中之一患膽道閉鎖，另一雙胎兒正常，兩患兒分別于生后168 d和63 d行Kasai手術(shù)，術(shù)中膽道造影和肝活檢結(jié)果符合肝外膽道梗阻診斷標(biāo)準(zhǔn)，于患兒術(shù)后2個(gè)月和3個(gè)月黃疸消退，隨訪期間未出現(xiàn)其他嚴(yán)重并發(fā)癥，預(yù)后良好。

2.2 雙胞胎染色體核型檢查結(jié)果 本組3對(duì)同卵雙胞胎BA患兒外周血染色體常規(guī)G顯帶核型分析結(jié)果顯示，核型分別為 46，XX 或 46，XY（圖 2），該組雙胎兒的染色體核型均未見異常，未見伴發(fā)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。

圖2 雙胞胎染色體核型檢測(cè)結(jié)果Fig 2 The results of twins karyotype test

2.3 雙胞胎外顯子測(cè)序結(jié)果

2.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)及覆蓋度 本組同卵雙胞胎的全外顯子組測(cè)序質(zhì)量較好，平均測(cè)序深度100×。將測(cè)序數(shù)據(jù)與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并通過Annovar軟

件對(duì)檢測(cè)到的突變位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。BA同卵雙胞胎測(cè)序結(jié)果顯示共檢測(cè)出10個(gè)差異SNP位點(diǎn)，但通過測(cè)序驗(yàn)證分析以上10個(gè)差異位點(diǎn)在雙胎兒中序列均一致，說明差異SNP位點(diǎn)是由檢測(cè)錯(cuò)誤造成的，本組單胎發(fā)病的BA同卵雙胞胎不存在SNP差異型。另外雙胎兒插入/缺失（InDel）和基因拷貝數(shù)（CNV）在雙胎兒中均未檢測(cè)到差異位點(diǎn)。

2.3.2 膽道閉鎖同卵雙胎兒的部分SNP位點(diǎn) 分析總結(jié)以往文獻(xiàn)報(bào)道過的與膽道閉鎖發(fā)生相關(guān)的部分SNP位點(diǎn)（表1）。

表1 雙胞胎BA患兒部分SNP位點(diǎn)Tab 1 Partial SNP loci in patients with twin BA

2.3.3 突變基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的整體分布情況 將全外顯子測(cè)序獲得的所有突變位點(diǎn)比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，結(jié)果顯示大多數(shù)變異位點(diǎn)都集中在免疫系統(tǒng)、病毒感染以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，說明在膽道閉鎖發(fā)生過程中免疫損傷和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等起重要作用（圖3）。

圖3 突變基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的分布情況Fig 3 Distribution of mutant genes in the KEGG database

3 討論

3.1 同卵雙胞胎BA患兒臨床特點(diǎn)分析 研究普遍認(rèn)為，術(shù)時(shí)年齡小于60 d的BA患兒，會(huì)獲得較好的預(yù)后[5-6]。kasai術(shù)時(shí)年齡越早，其肝細(xì)胞受損程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及肝纖維化程度越輕，患兒自體肝生存時(shí)間越長(zhǎng)。Shinkai等[7]的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，kasai術(shù)時(shí)年齡≤70 d的患兒與術(shù)時(shí)年齡＞70 d相比，前組20年自體肝存活率明顯高于后組，分別為50.88%和28.57%。本組BA患兒分別于生后49 d、63 d和168 d行kasai手術(shù)，術(shù)時(shí)肝纖維化程度較輕，術(shù)后膽汁引流通暢，黃疸消退較快，自體肝生存至今，預(yù)后較好。

成功的kasai術(shù)后肝內(nèi)膽汁引流通暢，黃疸多在6個(gè)月內(nèi)逐漸消退[8]。Wildhaber等[9]通過比較kasai術(shù)后黃疸消退組與未消退組患兒自體肝生存情況，結(jié)果顯示前組患兒2年、5年自體肝存活率明顯高于后者，分別為60%vs4.8%和60%vs0。本組BA雙胎兒術(shù)后黃疸消退較快，3個(gè)月內(nèi)黃疸完全消退，大、小便顏色恢復(fù)正常，隨訪至今肝功能指標(biāo)和肝臟纖維化特異性指標(biāo)多在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，患兒狀況良好。

3.2 同卵雙胞胎BA患兒染色體核型分析 人類的染色體是遺傳物質(zhì)的載體，也是細(xì)胞遺傳學(xué)的主要研究對(duì)象。染色體核型異常包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。同卵雙胞胎雖由同一個(gè)受精卵分裂、分化發(fā)育而來，但在發(fā)育成單獨(dú)個(gè)體的過程中，可發(fā)生染色體的異常而致病。染色體異常的患者可表現(xiàn)為智力低下、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、特殊體征以及發(fā)育異常等臨床特點(diǎn)。

文獻(xiàn)報(bào)道2對(duì)同卵雙胞胎同患急性淋巴細(xì)胞性白血病，但染色體核型不同，其中一對(duì)雙胞胎G顯帶染色體核型分別為46，XX和46，XX，t（4；11）（a21；q23）；另一對(duì)染色體核型分析結(jié)果為46，XY，-4，+10，-13，del(14)(q24)，-15，+2mar/46，XY 和46XY[10]。學(xué)者認(rèn)為宮內(nèi)單克隆起源假說以及胎盤內(nèi)轉(zhuǎn)移機(jī)制是同卵雙胎同時(shí)患病的主要原因，但不能除外不同克隆起源的可能，而且表觀遺傳學(xué)在疾病發(fā)展中可能還發(fā)揮著一定的作用，影響個(gè)體細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特性。Chang等[11]的研究中，一對(duì)同卵雙胞胎兒其中之一患21三體綜合征，其染色體核型為47，XY+21；另一雙胎兒為46，XY，染色體核型正常，且未出現(xiàn)任何臨床癥狀，認(rèn)為同卵雙胞胎出現(xiàn)不一致的染色體核型的原因，可能是前卵裂體開始時(shí)，母體21號(hào)染色體減數(shù)分裂未分離導(dǎo)致的，雙胎之一保持21三體，并且另一個(gè)雙胎體在胚胎形成之前即在桑葚胚或早期囊胚期進(jìn)行三體性拯救，使胎盤呈21三體嵌合體，胎兒為正常染色體組成。

回顧膽道閉鎖雙胎文獻(xiàn)，同卵雙胞胎單胎發(fā)病和雙胎都患病的病例均有報(bào)道，但單胎發(fā)病的情況更多見，通過檢索文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)關(guān)于BA患兒染色體核型分析的研究，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)同卵雙胞胎外周血進(jìn)行染色體G帶核型分析，結(jié)果顯示雙胎兒核型為46，XX或46，XY，未發(fā)現(xiàn)染色體核型異常，初步說明同卵雙胞胎BA患兒出現(xiàn)不同臨床表型可能與染色體異常無關(guān)。

3.3 同卵雙胞胎BA患兒全外顯子組測(cè)序分析 外顯子組測(cè)序是目前用于鑒別遺傳性疾病新發(fā)致病基因的重要研究工具。通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)是目前首次以同卵雙胞胎BA患兒為研究對(duì)象，進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，試圖找到膽道閉鎖遺傳學(xué)病因的研究。在3對(duì)雙胞胎中共檢測(cè)到10個(gè)差異SNP位點(diǎn)。差異SNP位點(diǎn)表現(xiàn)為該位點(diǎn)在雙胞胎之一是雜合子，在另一個(gè)雙胞兒是純合子，或者該位點(diǎn)在雙胞胎中均為純合子，但是具有不同的核苷酸。這些差異SNP位點(diǎn)通過測(cè)序?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上所有的差異SNP堿基序列在雙胞胎中均一致，說明以上10個(gè)差異SNP位點(diǎn)是由檢測(cè)錯(cuò)誤造成的，該組同卵雙胞胎兒之間所有SNP位點(diǎn)均一致。同時(shí)分析測(cè)序結(jié)果中的插入、缺失(Indel)以及基因拷貝數(shù)變異（CNV）情況,未檢測(cè)到以上各類型的差異基因型。本組BA同卵雙胞胎，雖單胎發(fā)病，出現(xiàn)不同的臨床表型，但雙胎兒之間不存在任何差異基因型，提示BA發(fā)生可能不是單純的遺傳性疾病，可能與外顯率或遺傳表觀修飾如DNA甲基化有關(guān)，有待下一步研究證實(shí)。

3.4 同卵雙胞胎BA患兒相關(guān)SNP位點(diǎn)分析 目前關(guān)于膽道閉鎖遺傳學(xué)病因的研究有很多，主要通過二代測(cè)序技術(shù)總結(jié)與膽道閉鎖相關(guān)的突變位點(diǎn)，但目前為止尚未發(fā)現(xiàn)與BA發(fā)生直接相關(guān)的基因突變。目前認(rèn)為與BA發(fā)生相關(guān)性較強(qiáng)的有ADD3、GPC1和VEGFA基因等。

ADD3基因編碼內(nèi)收蛋白-3，它在消化道、肝組織以及膽管上皮細(xì)胞的細(xì)胞連接處表達(dá)，主要參與細(xì)胞骨架的組裝、細(xì)胞遷移和收縮。學(xué)者Cheng等[12]通過基因芯片技術(shù)在339例BA組和401例正常對(duì)照組研究發(fā)現(xiàn)，在10q24.2的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)的SNP位點(diǎn)rs17095355可通過調(diào)控ADD3基因在肝組織的表達(dá)水平影響膽道系統(tǒng)的發(fā)育和相應(yīng)生物學(xué)功能。Tsai等[13]對(duì)高加索人171例BA患兒和1630例正常兒的ADD3基因進(jìn)行篩查，研究發(fā)現(xiàn)ADD3基因上的rs7099604與膽道閉鎖發(fā)生密切相關(guān)，且ADD3基因在BA患兒肝組織特異表達(dá)。

GPC1基因位于2q37.3上，主要編碼磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，可通過糖基-磷脂酰肌醇鍵連接到細(xì)胞膜上，在細(xì)胞之間發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，主要介導(dǎo)炎癥發(fā)生和通過Hedgehog信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)控細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)。學(xué)者Leyva-Vega[2]通過對(duì)30例BA患兒進(jìn)行全基因組多態(tài)性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示有2例BA患兒的2q37.3區(qū)域存在正?；蚩截悢?shù)片段的異常缺失。Cui等[14]利用全基因組相關(guān)性分析方法對(duì)位于2q37.3的GPC1進(jìn)行相關(guān)SNP位點(diǎn)和CNV變異分析比較，觀察到在BA患兒組中GPC1基因有明顯的拷貝數(shù)缺失，并利用斑馬魚對(duì)GPC1基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在敲除GPC1基因的斑馬魚中，該片段缺失后，斑馬魚幼體在短期內(nèi)就出現(xiàn)了膽道發(fā)育缺陷。

VEGFA基因位于6p12，編碼肝素結(jié)合蛋白，作為血管生成調(diào)節(jié)劑和炎癥反應(yīng)介質(zhì)，越來越多的證據(jù)表明VEGFA可能在BA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[15-16]。2010年學(xué)者Lee等[17]通過基因芯片技術(shù)，探究位于VEGFA基因上的SNP位點(diǎn)rs3025039與臺(tái)灣人的患BA的關(guān)系，結(jié)果證實(shí)該SNP位點(diǎn)可使患膽道閉鎖的風(fēng)險(xiǎn)增加。最近的一項(xiàng)研究對(duì)1 336名西北漢族中國(guó)人進(jìn)行VEGFA基因分型，包括311名BA患者和1 025名健康對(duì)照樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)rs3025039與BA風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性較強(qiáng)，rs3025039的CC基因型比其他兩種基因型的發(fā)病率高，表明C等位基因是一個(gè)患膽道閉鎖的風(fēng)險(xiǎn)等位基因[18]。

盡管目前關(guān)于BA基因?qū)W的研究有很多，以雙胎或家族性BA病例為研究背景的研究尚未見報(bào)道，可能由于BA本身的發(fā)病率較低，而且雙胞胎BA或家族性BA發(fā)病病例更為罕見。本組BA雙胎兒雖存在以往文獻(xiàn)報(bào)道的部分SNP位點(diǎn)，但雙胎兒之間基因型完全相同，提示單個(gè)或幾個(gè)核苷酸變異尚不足以致病。

3.5 突變基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的整體分布情況分析 目前普遍認(rèn)為BA發(fā)生是由遺傳、炎癥、免疫損傷、感染及其他環(huán)境條件等諸多因素共同作用的結(jié)果。從KEGG通路圖可以看出，免疫損傷、病毒感染以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在膽道閉鎖發(fā)生過程中起重要作用。

Treg細(xì)胞通過產(chǎn)生調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子、接觸抑制及競(jìng)爭(zhēng)作用等發(fā)揮免疫抑制作用，在自身免疫性疾病和感染性疾病中扮演著重要的角色，Th17細(xì)胞則起促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，可通過自身細(xì)胞增殖干擾Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能，阻斷Treg細(xì)胞的抗炎癥反應(yīng)能力。以往研究發(fā)現(xiàn)，BA患兒外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而Treg細(xì)胞數(shù)量顯著減少，隨著疾病進(jìn)展，Treg/Th17比值呈降低趨勢(shì)[19]。另外，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞之間平衡的紊亂還見于自身免疫性硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等，說明Treg/Th17細(xì)胞比率降低引起的免疫炎癥性紊亂參與了BA發(fā)生發(fā)展過程。

本實(shí)驗(yàn)以同卵雙胞胎BA患兒為研究對(duì)象，試圖通過染色體核型分析和全外顯子方法初步分析膽道閉鎖發(fā)生的遺傳學(xué)背景，但限于目前實(shí)驗(yàn)所獲取的雙胎兒血液樣本數(shù)量較少，難以得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，有待于繼續(xù)收集實(shí)驗(yàn)樣本，進(jìn)一步深入研究。

綜上，本組中雙胞胎膽道閉鎖患兒均為單胎發(fā)病，即雙胎之一患膽道閉鎖，另一雙胎兒出生正常，且隨訪期間未出現(xiàn)與黃疸相關(guān)疾病或伴發(fā)其他先天畸形。臨床表型不同的同卵雙胞胎BA患兒，其染色體核型無異常，提示膽道閉鎖發(fā)生可能與染色體異常無關(guān)；雙胎兒全外顯子組測(cè)序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異?；蛐?，提示膽道閉鎖發(fā)生可能不是單純的遺傳性疾病，可能在一定的遺傳學(xué)背景下，外在的某些環(huán)境因素如病毒感染、毒素、免疫損傷等觸發(fā)膽道閉鎖發(fā)生。