SOX6在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機制

付真睿，盛飛，張昌文，常泰浩，陳仕洋，喬寶民

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，美國癌癥協(xié)會預(yù)估2017年膀胱癌新增病例79 030例，死亡病例16 870例[1]，盡管大多數(shù)的膀胱癌為非肌層浸潤性的（70%～75%），但它們會隨著時間的推移而轉(zhuǎn)移并最終發(fā)展為肌層浸潤性疾病（25%～30%）[2]。膀胱癌的治療方法包括手術(shù)、化學(xué)療法或放射療法，但生存益處仍然有限，其發(fā)病率和死亡率在過去10年中逐漸增加[3]。因此，迫切需要提高對膀胱癌的認識并發(fā)現(xiàn)可用于治療膀胱癌更有效、高選擇性的潛在治療靶點。SOX6為SOX基因家族D亞族的主要成員之一，SOX家族蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子主要參與調(diào)控胚胎發(fā)育、性別決定、神經(jīng)生長、血管生成、骨骼形成、干細胞形成等生長發(fā)育過程[4-5]，近年來，越來越多的研究表明SOX6的異常表達與許多腫瘤相關(guān)[6-12]。蛋白酶體作為細胞蛋白質(zhì)的一種降解途徑，很多疾病發(fā)生發(fā)展也與之直接相關(guān)。蛋白酶體作為新型抗腫瘤藥物的一個重要靶標(biāo)，當(dāng)?shù)鞍酌阁w活性受到抑制后，其相關(guān)受體蛋白的降解受到抑制[13-15]。對SOX6通過蛋白酶體途徑影響膀胱癌生長進程的機制研究將有助于提升筆者對膀胱癌的認識和治療。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人膀胱癌組織與癌旁組織獲取于天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，膀胱癌細胞系（T24、BIU-87、EJ、5637）和正常膀胱上皮細胞（SVHUC-1）來自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所。兔單抗SOX6、兔單抗E-cadherin、兔單抗Vimentin、一抗兔單抗GAPDH、二抗羊抗兔購于proteintech公司，SOX6高表達質(zhì)粒 pcDNA3.1-SOX6和空載質(zhì)粒購于廣東復(fù)能基因公司。X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購于美國Roche公司，CCK8試劑盒、免疫組化試劑盒、多聚甲醛、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于Solarbio公司，Transwell小室購于美國Corning公司，ECL顯影液、SYBR Green預(yù)混液、蛋白Marker購于美國Thermo Fisher公司，細胞凋亡試劑盒、caspase3試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購于康為世紀(jì)公司，Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司，Trizol試劑購于Invitrogen公司，20 s蛋白酶體檢測試劑盒購于Sigma-Aldaich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人膀胱癌細胞系培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2～3d更換培養(yǎng)液1次，待細胞生長融合率達到80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1：2進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期，狀態(tài)良好的膀胱癌細胞于6孔板中，待細胞長至50%時按轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 免疫組化 組織標(biāo)本以10%甲醛液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm切片，貼附于涂有APES處理的載玻片上，85℃烤片90 min，免疫組織化學(xué)染色：（1）石蠟切片脫蠟；（2）3%H2O2室溫孵育5～10 min，以清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡 5 min；（3） 微波抗原修復(fù)；（4）5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，分別滴加一抗工作液，37℃孵育 1～2 h，PBS沖洗，5 min×3次；（5）滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育 20～30 min，PBS沖洗，5 min×3 次；（6）滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素，37℃孵育20～30 min，PBS沖洗，5 min×3 次；（7）DAB 顯色；（8）自來水充分沖洗、復(fù)染、封片。用已知陽性標(biāo)本作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.3 Western blot提取細胞總蛋白 用BCA法測定蛋白濃度，取30～40 μg總蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉搖床上室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST溶液洗3次，每次15 min。HRP標(biāo)記的二抗按照1∶1 500稀釋，室溫下孵育1 h，使用TBST溶液洗3次，每次15 min，滴加顯色劑，置于曝光儀內(nèi)顯影。

1.2.4 熒光實時定量PCR（qRT-PCR） 使用Trizol試劑法提取細胞RNA，使用核酸定量分析儀測定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用熒光定量PCR分析儀對cDNA進行擴增檢測，以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)程序如下：94℃3 min（預(yù)變性），94℃30 s（變性），56℃ 30 s（退火），72℃60 s（延伸），72℃ 5 min（最后延伸），42～45個循環(huán)。反應(yīng)完成后軟件分析結(jié)果（表1）。

表1 突變引物對Tab 1 Mutation primers

1.2.5 Transwell實驗 實驗參照Transwell 24孔板（美國Corning公司）說明書操作。胰酶消化收集細胞，應(yīng)用含0.5%血清的培養(yǎng)基重懸細胞，接種細胞于鋪好Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室，使細胞數(shù)為2×104個/孔，下室加入500 μL含10%血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，移去培養(yǎng)液，用乙醇棉簽擦拭去除小室底膜內(nèi)側(cè)細胞，小心取出上室，用預(yù)冷的50%甲醇固定10 min，PBS清洗3遍，結(jié)晶紫染色10 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察5個視野的細胞數(shù)。

1.2.6 細胞劃痕實驗 處理后的單細胞懸液接種于6孔板內(nèi)，待培養(yǎng)細胞至90%,用20 μL移液槍頭垂直劃痕，無菌PBS沖洗懸浮細胞及碎片2次，培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況。

1.2.7 細胞凋亡 實驗細胞轉(zhuǎn)染48 h后不含EDTA胰酶消化后，300 r/min，4℃離心5 min收集細胞，按照細胞凋亡試劑盒說明書加入結(jié)合緩沖液、AnnexinV和PI，6h內(nèi)在流式細胞儀上檢測凋亡指數(shù)。

1.2.8 CCK-8實驗 96孔板中加入100 μL細胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，在0、24、48、72 h向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育1～4 h，酶標(biāo)儀讀取待測樣品和空白對照在450 nm處的OD值，將各待測樣本的OD值記為測量值，空白對照的OD值記為空白值，則實際數(shù)值=測量值-空白值。

1.2.9 20 s蛋白酶體活性檢測實驗 避光96孔板中加入 90 μL（8×104）處理過的細胞，800 r/min 離心2 min，按說明書加入相關(guān)試劑，37°C，5%CO2過夜，在全波長多功能酶標(biāo)儀上發(fā)射波長490 nm檢測吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌中SOX6表達水平 與癌旁組織相比膀胱癌組織中的染色強度顯著減弱，可見SOX6蛋白表達在膀胱癌組織中明顯降低。使用Western blot和qRT-PCR分別檢測膀胱癌細胞和正常膀胱上皮細胞內(nèi)SOX6蛋白水平與mRNA水平表達情況，結(jié)果顯示膀胱癌細胞中SOX6的表達顯著降低，在EJ和5637細胞尤其明顯（圖1）。

圖1 SOX6在組織和細胞器中的表達情況Fig 1 The expression of SOX6 in tissues and cells

2.2 SOX6抑制膀胱癌侵襲和遷移能力 Transwell實驗（圖2）和劃痕實驗（圖3）結(jié)果顯示，與對照vector組相比，高表達SOX6后的EJ和5637細胞的侵襲能力顯著下降。同時，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的分子標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達升高，Vimentin表達減低（圖4）。

圖2 SOX6表達增加對膀胱癌EJ和5637細胞的侵襲能力的影響（40×）Effect of up-regulation SOX6 on invasion of EJ and 5637 (40×)

圖3 SOX6表達增加對膀胱癌EJ和5637細胞的侵襲能力的影響（40×）Fig 3 Effect of up-regulation SOX6 on migration of EJ and 5637(40×)

圖4 SOX6表達增加對膀胱癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Fig 4 Influence of up-expression SOX6 onEpithelial-mesenchymal transition(EMT)of bladder cancer cells

2.3 SOX6抑制膀胱癌的增殖和促進凋亡 CCK-8實驗和流式細胞術(shù)結(jié)果表明，與對照vector組相比，SOX6表達增加后能夠抑制膀胱癌細胞EJ和5637的增殖，并且能夠促進膀胱癌的凋亡，同時細胞caspase3的活性顯著增加（圖5）。

2.4 SOX6能夠通過蛋白酶體途徑影響膀胱癌的進程 與正常膀胱上皮細胞相比膀胱癌細胞EJ與5637的20 s蛋白酶體的活性相對增加，在膀胱癌細胞中調(diào)高SOX6的表達量后，20 s蛋白酶體的活性顯著減低（圖6）。

圖5 SOX6表達增加對膀胱癌EJ和5637細胞的凋亡和增殖能力影響Fig 5 Influence of up-expression SOX6 on apoptosis and proliferation of EJ and 5637

圖6 SOX6表達增加對膀胱癌EJ和5637細胞的20 s蛋白酶體活性的影響Fig 6 Influence of up-expression SOX6 on the activity of 20 sproteasome of EJ and 5637

3 討論

SOX6作為多功能轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)組織分化并參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，SOX6的表達量與食管癌的預(yù)后顯著相關(guān)，通過上調(diào)p53和p21WAF1/CIP1抑制食管癌的致瘤能力[8]。在胰腺癌中，SOX6通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和AKT通路抑制腫瘤的增殖和侵襲[9]。SOX6的表達抑制卵巢癌的增殖、侵襲、移植瘤生長和血管生成[6]。但是，SOX6和膀胱癌的關(guān)系目前還不清楚。

近年來，對于蛋白酶體的研究日益漸增，蛋白酶體作為一個多亞基大分子復(fù)合物，具有多種催化功能，能選擇性降解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，是細胞新陳代謝的一個重要組成部分[16]。相對于正常的細胞，腫瘤細胞對蛋白酶體抑制劑更加敏感，通過影響腫瘤細胞的相關(guān)通路從而抑制腫瘤細胞，同時，多種腫瘤中的蛋白酶體處于高活性狀態(tài)[17]。因此，蛋白酶體漸漸成為抗腫瘤藥物的一個靶點，當(dāng)?shù)鞍酌阁w活性被抑制時，腫瘤抑制蛋白p53的含量增加，促進細胞凋亡；免疫相關(guān)蛋白降解減少，免疫監(jiān)視能力增加。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)了與膀胱的正常組織相比，膀胱癌中SOX6處于低表達狀態(tài)，在體外實驗中，通過增加SOX6的表達，發(fā)現(xiàn)膀胱癌的增殖、侵襲、遷移能力下降，凋亡增加。并進一步驗證了蛋白酶體在膀胱癌中的活性情況，通過調(diào)高SOX6，意外發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞中的蛋白酶體活性減低。SOX6可能通過抑制蛋白酶體活性從而調(diào)節(jié)膀胱癌的腫瘤行為，在聯(lián)合蛋白酶體抑制劑治療膀胱癌方面有很好的前景。