弗氏檸檬酸桿菌的篩選、鑒定及對(duì)分散藍(lán)2BLN脫色性能

蘆銀香，范曉丹，胡宗玉，吳 靜

（天津城建大學(xué)a.環(huán)境與市政工程學(xué)院；b.天津市水質(zhì)科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

我國是染料生產(chǎn)大國，且居于世界首位[1].據(jù)統(tǒng)計(jì)合成染料在生產(chǎn)和使用過程中大約有10%～20%染料釋放到水中，且每排放1 t 染料廢水，就會(huì)污染20 t 水體[2].根據(jù)染料所含的共軛體系結(jié)構(gòu)可分為偶氮染料、蒽醌染料及三苯甲烷類染料等，其中蒽醌染料是僅次于偶氮染料的第二大類染料[3-4].蒽醌類染料分子結(jié)構(gòu)中含蒽醌基，它具有色澤鮮艷、耐光度好及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[5-6].蒽醌染料因色度大影響日光照射，不利于水生生物和植物的生長[7-8]；某些蒽醌染料能夠致癌、致畸、致突變[9]；因此，有效去除水體中蒽醌類染料是十分有必要的.

目前，國內(nèi)外針對(duì)印染廢水的處理方法可以分為物理法、化學(xué)法以及生物處理法.但物理、化學(xué)法因成本高、操作復(fù)雜及易產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn)，很大程度上限制了其發(fā)展[10].從污水處理廠的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)適應(yīng)性和廣泛的適應(yīng)性的角度而言，生物處理法具有顯著的優(yōu)勢[11].處理染料廢水的生物包括細(xì)菌、真菌及藻類，細(xì)菌的處理效果優(yōu)于真菌和藻類[12-13]，越來越多的細(xì)菌被用于處理染料廢水[14-17].這些報(bào)道主要是關(guān)于偶氮染料廢水的處理，對(duì)于蒽醌染料廢水的研究相對(duì)少一些[18-20].

本研究從天津市某污水處理廠二沉池污泥中分離篩選出一株對(duì)蒽醌分散藍(lán)2BLN 具有較強(qiáng)脫色能力的菌株，經(jīng)16SrDNA 基因序列分析，鑒定為弗氏檸檬酸桿菌.探討影響菌種的生理學(xué)特征，獲得最適生長條件并研究其對(duì)蒽醌分散藍(lán)2BLN 的脫色性能.

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

污泥取自天津市某污水處理廠二沉池.模擬染料廢水的組成（g/L）：C6H6O61、（NH4）2S040.1、KH2PO40.03、MgSO40.2、CaCl20.01、FeCl30.01、NaCl 1 及染料（蒽醌分散藍(lán)2BLN）.

富集培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸膏5，氯化鈉10，pH=7.0～7.2.

LB 固體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸膏5，氯化鈉10，瓊脂粉20，pH=7.0～7.2.

分散藍(lán)2BLN、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、氯化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、三氯化鐵、重鉻酸鉀，硫酸亞鐵銨，上述藥品均為分析純.

1.2 儀器及設(shè)備

電子天平（FA2004N 型，上海菁海儀器有限公司）；全溫振蕩培養(yǎng)箱（ZWYR-200D 型，上海智城分析儀器制造有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（T6 新世紀(jì)型，北京普析通用儀器有限公司）；微波消解裝置（WMX-Ⅲ-B 型，韶關(guān)市明天環(huán)保儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；超凈工作臺(tái)（SWCJ-1F 型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）.

1.3 菌種的馴化、分離、純化、篩選

將配制好的廢水和污泥放置錐形瓶內(nèi)，置于溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的振蕩箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng).首次加入染料廢水濃度為5 mg·L-1，采用梯度馴化，直到各個(gè)濃度的色度及COD 去除效果趨于穩(wěn)定，馴化完成.用梯度稀釋、涂布平板的方法對(duì)馴化后的活性污泥中菌種反復(fù)分離純化，得到兩株細(xì)菌，命名為H1 和H2，通過比較它們的脫色率及COD 去除率，篩選出一株優(yōu)勢菌種.

1.4 高效脫色菌種的鑒定

對(duì)高效菌種（H2）的16SrDNA 的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序與分析（委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行）：使用細(xì)菌基因組DNA 小量純化試劑盒提取基因組DNA.細(xì)菌16SrDNA 基因的引物序列為引物27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；引物1492R：5’-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3’.反應(yīng)體系包括反應(yīng)緩沖液15 μL，Taq 酶1 μL，DNTP10 μL,模板DNA1 μL，27 引物1 μL,1492R 引物1 μL，最后用去離子水補(bǔ)充至50 μL.PCR 反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性3 min；96 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.將獲得的16SrDNA 序列通過BLAST 程序與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，選取12 株序列相似性高的標(biāo)準(zhǔn)菌株，用Neighbor Joining（NJ）建樹方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 菌種生理學(xué)特征

用△OD600表征菌種凈生長量.將培養(yǎng)好的種子液按10%（v/v）的接種量接種模擬染料廢水中（染料濃度為40 mg·L-1），在搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1下，研究不同溫度（20，25，30，35，40 ℃）對(duì)菌種生長的影響；在最適溫度下，研究轉(zhuǎn)速（0，50，100，150，200 r·min-1）對(duì)菌種生長的影響；在最適溫度、轉(zhuǎn)速下，研究接種量（1%，5%，10%，15%，20%）對(duì)菌種生長的影響；在最適接種量、溫度、轉(zhuǎn)速下，研究不同pH（2，4，6，7，8，10，11）對(duì)菌種生長的影響；每隔1.5 h 取樣測OD600.

1.6 脫色率和COD 去除率

將處理前后的水樣在轉(zhuǎn)速為10 000 rpm/min 下離心10 min，取上清液，在最大波長625 nm 處測出吸光度.根據(jù)廢水降解前、后吸光度的變化計(jì)算出脫色率.脫色率計(jì)算公式如下式

式中：A0為進(jìn)水吸光度值；At為t 時(shí)刻出水吸光度值.

采用重鉻酸鉀法測定COD，COD 去除率計(jì)算公式為

式中：COD0為進(jìn)水COD 值，CODt為t 時(shí)刻出水COD 值.

1.7 紫外-可見光譜分析

將處理前后的水樣在轉(zhuǎn)速為10 000 rpm/min 下離心10 min，取上清液稀釋5 倍于300～700 nm 處進(jìn)行紫外-可見波譜分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 高效菌種篩選

菌株H1、H2 對(duì)蒽醌分散藍(lán)（40 mg·L-1）隨時(shí)間變化的脫色率及COD 去除率如圖1 所示：8 d 后，H1、H2的脫色率分別為65.4%、79.14%；H1、H2 的COD 去除率分別57.97%、86.08%；H2 的脫色率及COD 去除率均高于H1.因此，本實(shí)驗(yàn)選擇H2 為目標(biāo)菌株.

圖1 H1 和H2 的脫色率及COD 去除率

2.2 H2 的鑒定

純化后的H2 菌株在LB 固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h 后，形成直徑為2～4 mm 的單菌落.H2 菌株的菌落（見圖2a）特征為圓形、表面有光澤、乳白色、不透明、易挑起，該菌為革蘭氏陰性菌，桿狀；16SrDNA 序列通過BLAST 程序與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，選取12 株序列相似性高的標(biāo)準(zhǔn)菌株，用Neighbor Joining（NJ）建樹方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2b）；生工生物工程（上海）股份有限公司給出的菌株鑒定結(jié)果報(bào)告（見圖2c）；綜上所述，H2 鑒定為弗氏檸檬酸桿菌.

圖2 菌株鑒定結(jié)果

2.3 弗氏檸檬酸桿菌（H2）生理學(xué)特征

2.3.1 生長溫度范圍及最適值

溫度對(duì)弗氏檸檬酸桿菌影響結(jié)果如圖3a 所示.由圖可知，在20 ℃和25 ℃時(shí)，該菌株基本上不能生長，這是因?yàn)榈蜏匾种屏嗣傅幕钚?；?0 ℃到40 ℃，菌種均能較好的生長，但△OD600從0.647 4 降至0.432 4，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，雖然酶促反應(yīng)加快，但酶活性喪失也加速；溫度變化既可以引起菌體細(xì)胞壁表面發(fā)生物理變化，也可影響分泌酶系的活性和穩(wěn)定性[21].因此，溫度對(duì)弗氏檸檬酸桿菌生長影響較大，且最適生長溫度為30 ℃.

2.3.2 生長轉(zhuǎn)速范圍及最適値

通過改變培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)錐形瓶內(nèi)的含氧量.轉(zhuǎn)速對(duì)弗氏檸檬酸桿菌影響結(jié)果如圖3b 所示.由圖可知，隨著轉(zhuǎn)速（0 r·min-1～200 r·min-1）的增大，該菌株生長趨勢呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢.當(dāng)轉(zhuǎn)速為0～150 r·min-1時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增大，菌體生長的越好，這是因?yàn)檩^高轉(zhuǎn)速可為其提供足夠氧氣去維持該菌株的新陳代謝，說明該細(xì)菌是兼性好氧菌；但轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時(shí)，該菌體生長趨勢反而有所下降，這是因?yàn)楦咿D(zhuǎn)速影響其機(jī)械強(qiáng)度，進(jìn)一步影響了該菌體的生長.因此，弗氏檸檬酸桿菌最適轉(zhuǎn)速為150 r·min-1.

2.3.3 生長接種量范圍及最適値

接種量對(duì)弗氏檸檬酸桿菌影響結(jié)果如圖3c 所示：由圖可知，當(dāng)接種量為15%時(shí)，該菌株凈生長量最大，且9 h 時(shí)△OD600 為0.585 8；在前3 h，接種量越大（1%～20%），菌株生長越快，但之后20%生長趨勢不如15%.這是因?yàn)橐婚_始接種量為20%的反應(yīng)器內(nèi)，微生物數(shù)量最多，繁殖最快，隨著時(shí)間越來越長，營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，微生物進(jìn)入了穩(wěn)定期和衰老期.因此，弗氏檸檬酸桿菌最適接種量為15%.

2.3.4 生長pH 范圍及最適値

pH 對(duì)弗氏檸檬酸桿菌影響結(jié)果如圖3d 所示：由圖可知，在pH = 2 時(shí)，該菌株基本上不能生長，這說明該菌株不能在強(qiáng)酸環(huán)境生長；在當(dāng)pH = 4～7 時(shí)，隨著pH 增大，該菌株△OD600越大，這說明該菌株能在弱酸環(huán)境下生長，且在中性環(huán)境下生長的最好；當(dāng)pH = 8～11 時(shí)，△OD600越來越小，這說明該菌株能在弱堿性下生長，但強(qiáng)堿抑制其生長，且pH=11時(shí)，基本上不能生長.綜上所述，過酸或過堿均會(huì)引起微生物細(xì)胞表面特性與酶構(gòu)象的變化，進(jìn)而影響微生物的生長和代謝[22].因此，弗氏檸檬酸桿菌最適pH=7.

圖3 菌株最適生長條件

2.4 紫外-可見波譜分析

反應(yīng)前后的水樣紫外-可見波譜分析結(jié)果如圖4所示.在最適生長條件下，反應(yīng)8 d 后分散藍(lán)2BLN 在波長584 nm 和620 nm 處的特征吸收峰逐漸減弱，最終基本消失，這與反應(yīng)液的顏色由藍(lán)色漸變?yōu)闊o色相一致，且此時(shí)脫色率為86.10%.由此推斷分散藍(lán)2BLN的蒽醌環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)色基團(tuán)發(fā)生明顯變化.當(dāng)細(xì)菌以生物吸附的方式進(jìn)行脫色時(shí)，所有吸收峰的吸光值將出現(xiàn)等比例的下降；當(dāng)以生物降解的方式進(jìn)行脫色時(shí)，上清液在可見光區(qū)的吸收峰將完全消失，或者出現(xiàn)新的吸收峰[23].因此，弗氏檸檬酸桿菌對(duì)蒽醌分散藍(lán)2BLN 的脫色是通過生物降解的方式來實(shí)現(xiàn)的.

3 結(jié) 論

圖4 紫外-可見波譜分析

（1）從一般的市政活性污泥中分離到一株具有高效脫色分散藍(lán)2BLN 的菌株.經(jīng)16SrDNA 鑒定，該菌株為弗氏檸檬酸桿菌，屬于枸櫞酸桿菌屬.

（2）弗氏檸檬酸桿菌最適生條件：溫度為30 ℃，培養(yǎng)箱振蕩頻率為150 r·min-1，pH=7.8 d 后，分散藍(lán)2BLN（40 mg·L-1）脫色率達(dá)86.10%.

（3）弗氏檸檬酸桿菌對(duì)蒽醌分散藍(lán)2BLN 的脫色是通過生物降解的方式且分散藍(lán)2BLN 的蒽醌環(huán)被破壞.

（4）綜上所述弗氏檸檬酸桿菌是一株高效蒽醌染脫色菌，具有處理蒽醌染料廢水的開發(fā)潛能.