長鏈非編碼RNA CCAT1通過促進上皮間充質轉化對口腔鱗狀細胞癌細胞侵襲和遷移能力的影響①

陳 敏 張 楠 周 政

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔科，石河子 832008)

口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是發(fā)生于口腔鱗狀上皮細胞覆蓋及其毗鄰部位的一種惡性腫瘤[1]。它是口腔癌的主要類型，約占口腔癌總發(fā)病率的90%，也是在印度發(fā)病率最高的癌癥[2，3]。調查表明，煙草、酒精、檳榔和人乳頭瘤病毒等是引起OSCC的重要因素[4]。早期OSCC患者多進行手術切除治療預后良好，晚期OSCC患者經(jīng)手術、放療化療綜合治療后仍預后不良，5年生存率約為50%[5]。近年來OSCC的發(fā)病率逐年上升[1]，成為醫(yī)學研究的熱點。了解OSCC的發(fā)病機理是尋找其有效治療方法的重要前提。大量研究表明，非編碼RNA異常表達是癌癥發(fā)生發(fā)展的潛在標志[6-8]。據(jù)報道，長鏈非編碼RNA結腸癌相關轉錄因子1(Colon cancer associated transcript 1,CCAT1)在OSCC組織中過度表達并預示預后不良[3]。CCAT1是一種促癌因子，在多種癌癥中過度表達[9-13]。同時，CCAT1可通過誘導肺腺癌細胞上皮間充質轉化促進肺腺癌的轉移[13]。在OSCC中，上皮間充質轉化機制被過度激活[14]，但目前關于CCAT1對OSCC細胞上皮間充質轉化及細胞侵襲、遷移的影響還沒有被進一步研究。本文通過檢測CCAT1在癌旁組織、癌組織及各OSCC細胞系的表達，進而通過沉默CCAT1，探究其對上皮間充質轉化及細胞侵襲、遷移的影響，進一步明確CCAT1在OSCC的作用機理，為尋找治療OSCC的有效方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗試劑 Trizol、總RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司。反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒、脂質體2000轉染試劑盒來自美國ThermoFisher公司。所用引物及RNA購自北京六合華大基因公司。RPMI1640培養(yǎng)液及胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。青霉素-鏈霉素溶液(×100)、CCK8試劑盒、Hoechst染色試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和T細胞因子4(T cell factor 4,TCF-4)抗體購自美國Santa Cruz公司。鈣依賴性黏附蛋白E(Calcium-dependent adhesion protein E,E-cadherin)和鈣依賴性黏附蛋白N(N-cadherin)抗體購自美國R&D Systems公司。Snail、β-連環(huán)素(β-catenin)和細胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)抗體購自美國Abcam公司。3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體及所有二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.2組織及細胞 正?？谇火つそM織由天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院提供，OSCC組織由天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院檢測確認并提供。OSCC細胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25和Tca83購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 條件為37℃、5% CO2，細胞培養(yǎng)液為含有1%青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。細胞傳代條件為細胞融合率≥85%，傳代濃度為1×104個/ml。

1.2.2分組及轉染 將細胞分為空白對照(Control)、shRNA 對照(sh-scramble)和sh-CCAT1組。細胞以0.1×106個/ml的濃度接種于6孔板中。24 h后，轉染細胞。轉染步驟參考轉染試劑盒說明書，轉染6 h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗檢測。

1.2.3RT-PCR檢測CCAT1的mRNA水平 于通風櫥中抽提各檢測樣品總RNA，抽提步驟參考總RNA提取試劑盒說明書。將抽提所得的各樣品總RNA定量分析后，取等量RNA反轉錄為cDNA，反轉錄步驟參考反轉錄試劑盒說明書。PCR儀將cDNA擴增后，利用SYBR green實時定量PCR試劑盒對各樣品進行定量分析。CCAT1上游引物序列:5′-AGGGAGTGTC-TAGTTGCAGG-3′,下游引物序列:5′-CACCAGGGAC-CAGTTTTGTG-3′。

1.2.4CCK8檢測SCC9細胞增殖情況 首先將1.2.2中各組細胞培養(yǎng)0、1、2、3、4 d，然后根據(jù)CCK8試劑盒說明書，每孔分別加入10 μl CCK8溶液，37℃孵育3 h。于450 nm處檢測各組細胞吸光度，計算細胞增殖生長倍數(shù)。

1.2.5Hoechst染色檢測SCC9細胞凋亡情況 首先將1.2.2中各組細胞進行固定，然后利用Hoechst染色試劑盒進行染色，最后利用熒光顯微鏡進行檢測。在激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm的條件下，可檢測到呈藍色的細胞核，染色步驟參考Hoechst染色試劑盒說明書。

1.2.6劃痕實驗檢測SCC9細胞遷移能力 實驗之前先將6孔細胞培養(yǎng)板背面畫橫線，每孔至少有5條橫線且穿過板孔，各橫線間隔0.8 cm左右，橫線需均勻而筆直。然后在板中培養(yǎng)SCC9細胞，并按1.2.2中分組方法轉染細胞。待細胞鋪滿板孔后，用100 μl中號槍頭盡量垂直于其背面橫線進行劃痕。劃痕后用PBS洗滌板孔，加入無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。取0和24 h拍照，計算劃痕閉合率。劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7Transwell實驗檢測SCC9細胞侵襲能力 實驗之前先將Matrigel放于4℃融化，融化后取少量Matrigel到Transwell小室中進行預包被。將1.2.2中各組細胞接種于上室并用無血清細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，24 h后，用棉簽拭去濾膜上層未轉移細胞，HE染色液對下層轉移細胞進行染色并計數(shù)。

1.2.8免疫印跡檢測蛋白表達 首先用RIPA裂解1.2.2中各組細胞提取細胞蛋白，然后用BCA試劑盒對蛋白濃度定量并調平蛋白濃度。取30 μg蛋白進行實驗，用10% SDS-PAGE將蛋白分離，半干轉膜法將蛋白轉移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，最后曝光顯色并以β-actin為內參。

1.3統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布分析和方差齊性分析，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)用單因素方差分析或t檢驗，不符合條件的數(shù)據(jù)用秩和檢驗。

2 結果

2.1CCAT1在正?？谇火つそM織和口腔鱗狀細胞癌組織中的mRNA水平 與正?？谇火つそM織比較，口腔鱗狀細胞癌組織中CCAT1的mRNA水平顯著升高(P<0.001，圖1)。提示CCAT1上調可能與口腔鱗狀細胞癌有關。

圖1 RT-PCR檢測正?？谇火つそM織與口腔鱗狀細胞癌組織中CCAT1的mRNA水平Fig.1 mRNA level of CCAT1 in normal tissue and oral squamous cell carcinoma tissue were evaluated by RT-PCRNote: n=20,***.P<0.001 vs normal tissue.

2.2CCAT1在口腔角質細胞系和口腔鱗狀上皮細胞癌細胞系中的mRNA水平 與正常口腔角質細胞系hNOK比較，口腔鱗狀上皮細胞癌細胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25和Tca83中CCAT1的mRNA水平顯著升高(P<0.001，圖2)，本文中選用SCC-9進行后續(xù)實驗。實驗結果提示CCAT1上調可能與口腔鱗狀細胞癌有關。

2.3sh-CCAT1降低SCC-9細胞中CCAT1的mRNA水平 與Control組比較，sh-scramble組細胞中CCAT1的mRNA水平無顯著差異，sh-CCAT1組中CCAT1的mRNA水平顯著降低(P<0.001，圖3)。實驗結果表明，sh-CCAT1可顯著下調CCAT1。

2.4sh-CCAT1降低SCC-9細胞增殖速率 與Control組比較，sh-scramble組細胞增殖速率無顯著差異，sh-CCAT1組細胞增殖速率顯著下降(P<0.001，圖4)。此外，與Control組比較，sh-scramble組中細胞增殖相關蛋白PCNA的表達無顯著差異，sh-CCAT1組中PCNA的表達顯著下降(P<0.001，圖5)。實驗結果表明，sh-CCAT1可阻礙SCC-9細胞的增殖。提示CCAT1有利于SCC-9細胞的增殖。

圖2 RT-PCR檢測hNOK、SCC-4、SCC-9、SCC-25和Tca83細胞系中CCAT1的mRNA水平Fig.2 mRNA level of CCAT1 in hNOK,SCC-4,SCC-9,SCC-25 and Tca83 cell lines were evaluated by RT-PCRNote: n=6,***.P<0.001 vs hNOK cell line.

圖3 RT-PCR檢測sh-CCAT1對CCAT1 mRNA水平的影響Fig.3 Effect of sh-CCAT1 on mRNA level of CCAT1 were evaluated by RT-PCRNote: n=6,***.P<0.001 vs control group.

2.5sh-CCAT1提高SCC-9凋亡細胞百分比 與Control組比較，sh-scramble組的凋亡細胞百分比無

圖4 CCK8試劑盒檢測sh-CCAT1對SCC-9細胞增殖的影響Fig.4 Effect of sh-CCAT1 on proliferation in SCC-9 cells were evaluated by CCK8Note: n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖5 免疫印跡檢測sh-CCAT1對SCC-9細胞表達PCNA、MMP-2和VEGF的影響Fig.5 Effect of sh-CCAT1 on expressions of PCNA,MMP-2 and VEGF in SCC-9 cells were evaluated by immunoblottingNote: n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖6 Hoechst染色法檢測sh-CCAT1對SCC-9細胞凋亡的影響(×400)

Fig.6 Effect of sh-CCAT1 on apoptosis in SCC-9 cells were evaluated by Hoechst staining(×400)

Note:n=6,***.P<0.001 vs control group.

顯著差異，sh-CCAT1組的凋亡細胞百分比顯著提高(P<0.001，圖6)。實驗結果表明，sh-CCAT1可促進SCC-9細胞凋亡。提示CCAT1可抑制SCC-9細胞凋亡。

2.6sh-CCAT1降低SCC-9細胞劃痕閉合率 與Control組比較，sh-scramble組的細胞劃痕閉合率無顯著差異，sh-CCAT1組的細胞劃痕閉合率顯著下降(P<0.001，圖7)。實驗結果表明，sh-CCAT1可降低SCC-9細胞的遷移能力。提示CCAT1可提高SCC-9細胞的遷移能力。

2.7sh-CCAT1減少SCC-9侵襲細胞數(shù) 與Control組比較，sh-scramble組侵襲細胞數(shù)無顯著差異，sh-CCAT1組侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.001，圖8)。此外，與Control組比較，sh-scramble組中侵襲遷移相關蛋白MMP-2和VEGF[19,20]的表達無顯著差異，sh-CCAT1組中MMP-2和VEGF的表達顯著下降(P<0.001，圖5)。實驗結果表明，sh-CCAT1可降低SCC-9細胞的侵襲能力。提示CCAT1可提高SCC-9細胞的侵襲能力。

圖7 劃痕實驗檢測sh-CCAT1對SCC-9細胞遷移的影響(×200)Fig.7 Effect of sh-CCAT1 on migration in SCC-9 cells were evaluated by wound healing assay(×200)Note: n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖8 侵襲實驗檢測sh-CCAT1對SCC-9細胞侵襲的影響(×400)

Fig.8 Effect of sh-CCAT1 on invasion in SCC-9 cells were evaluated by Transwell assay(×400)

Note:n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖9 免疫印跡檢測sh-CCAT1對SCC-9細胞表達E-cadherin、N-cadherin和Snail的影響Fig.9 Effect of sh-CCAT1 on expressions of E-cadherin,N-cadherin and Snail in SCC-9 cells were evaluated by immunoblottingNote: n=6,***.P<0.001 vs control group.

圖10 免疫印跡檢測sh-CCAT1對SCC-9細胞表達β-catenin、TCF4和Cyclin-D1的影響Fig.10 Effect of sh-CCAT1 on expressions of β-catenin,TCF4 and Cyclin-D1 in SCC-9 cells were evaluated by immunoblottingNote: n=6,***.P<0.001 vs control group.

2.8sh-CCAT1抑制SCC-9細胞上皮間充質轉化 與Control組比較，sh-scramble組中E-cadherin(上皮標記物)、N-cadherin(間質標記物)和Snail(E-cadherin抑制因子)[21-24]的表達無顯著差異， sh-CCAT1組中E-cadherin的表達顯著增加，N-cadherin和Snail的表達顯著減少(P<0.001，圖9)。實驗結果說明，sh-CCAT1對SCC-9細胞上皮間充質轉化有抑制作用。提示CCAT1對SCC-9細胞上皮間充質轉化有促進作用。

2.9sh-CCAT1抑制SCC-9細胞Wnt/β-catenin通路激活 與Control組比較，sh-scramble組中β-catenin、TCF4和Cyclin-D1的表達無顯著差異，sh-CCAT1組中β-catenin、TCF-4和Cyclin-D1的表達顯著減少(P<0.001，圖10)。實驗結果說明，sh-CCAT1抑制SCC-9細胞中Wnt/β-catenin通路的激活。提示CCAT1可促進SCC-9細胞中Wnt/β-catenin通路的激活。

3 討論

LncRNA是指長度大于200個氨基酸的非編碼RNA，在細胞中多發(fā)揮調節(jié)作用，如調節(jié)細胞增殖、細胞周期進程、細胞凋亡及存活等過程。近來大量研究表明，LncRNA的異常表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[6-8]。CCAT1是一種與癌癥有關的LncRNA，在結腸癌、胃癌、膽囊癌、肝癌、肺腺癌等多種癌癥中均高度表達[9-13]。同時，CCAT1也在OSCC組織中高度表達，并預示OSCC患者預后不良[3]。而目前關于CCAT1在OSCC中作用機制及其影響還有待進一步研究。為進一步探索CCAT1對OSCC的作用機制及影響，本文首先對CCAT1在OSCC組織及細胞中的表達情況進行檢測，并觀察到CCAT1在OSCC組織及細胞株SCC-4、SCC-9、SCC-25 和Tca83中的mRNA水平顯著升高，且其在SCC-9中的mRNA水平高于其他細胞株，故選用SCC-9進行后續(xù)實驗。

作為促癌因子，CCAT1可促進多種癌細胞增殖并抑制其凋亡。據(jù)報道，在胰腺癌細胞中，CCAT1被c-Myc靶向激活并高度表達，沉默CCAT1表達顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[15]。也有研究表明，在胃癌細胞中，CCAT1通過靶向下調microRNA-219-1提高癌細胞增殖能力，沉默CCAT1表達可減少癌細胞增殖并提高細胞凋亡水平。在本文中，sh-CCAT1可顯著下調SCC-9細胞中CCAT1 mRNA水平，降低SCC-9細胞增殖速率及相關蛋白PCNA的表達，并提高SCC-9凋亡細胞百分比。PCNA是增殖細胞核抗原，在DNA復制和修復、細胞周期調控及蛋白質降解過程中發(fā)揮重要作用，被視為評價細胞增殖能力的經(jīng)典指標[16]。實驗結果說明，沉默CCAT1可顯著抑制SCC-9細胞增殖并促進細胞凋亡。提示CCAT1可促進OSCC細胞SCC-9增殖并抑制細胞凋亡。

侵襲和遷移能力是癌細胞具有的基本特征，癌細胞侵襲和遷移是癌癥轉移的關鍵因素。研究表明，CCAT1可提高多種癌細胞的侵襲和遷移能力，并且促進癌癥的轉移。如在甲狀腺癌中，CCAT1通過靶向下調microRNA-143提高癌細胞侵襲和遷移能力并發(fā)揮促癌癥轉移功能，抑制CCAT1表達后，microRNA-143顯著上調且細胞侵襲和遷移能力顯著降低[17]。同時在喉鱗狀細胞癌中，過度表達的CCAT1可顯著促進癌細胞的遷移和侵襲[18]。本文利用sh-CCAT1沉默CCAT1后發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，sh-CCAT1組中SCC-9細胞劃痕閉合率顯著降低，侵襲細胞數(shù)及MMP-2和VEGF的表達顯著減少。VEGF可刺激血管內皮細胞生長，有利于癌細胞侵襲和遷移，是侵襲和遷移過程中的關鍵蛋白[19]。MMP-2是基質金屬蛋白酶家族的一員，可促進癌細胞侵襲和血管生成，有利于癌組織浸潤轉移[20]。實驗結果說明，沉默CCAT1可顯著降低SCC-9細胞侵襲和遷移能力。提示CCAT1可提高OSCC細胞SCC-9侵襲和遷移能力。

研究發(fā)現(xiàn)通過上皮間充質轉化，癌細胞可獲得較高的侵襲和遷移能力[21,22]。上皮間充質轉化是指細胞由上皮形態(tài)轉變?yōu)殚g充質形態(tài)的現(xiàn)象，其分子水平上主要變化為E-cadherin減少、N-cadherin及Snail增多。其中E-cadherin作為上皮細胞標記物，N-cadherin作為間質標記物，Snail是上皮間充質轉化的轉錄誘導因子，可抑制E-cadherin表達、促進N-cadherin表達[23,24]。據(jù)報道，在喉鱗狀細胞癌、肺腺癌和肝內膽管細胞癌等癌癥中，CCAT1可顯著促進癌細胞的上皮間充質轉化[13,18,25]。同時研究表明，在OSCC中，CCAT1高度表達且上皮間充質轉化過度激活[3,26]，于是本文在沉默CCAT1后，對上皮間充質轉化相關蛋白進行檢測。發(fā)現(xiàn)與Control組比較，sh-CCAT1組SCC-9細胞中E-cadherin的表達顯著提高，N-cadherin和Snail的表達顯著降低，說明沉默CCAT1對SCC-9細胞上皮間充質轉化有抑制作用。提示CCAT1可促進SCC-9細胞上皮間充質轉化。

研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與上皮間充質轉化的發(fā)生存在密切聯(lián)系，活化的Wnt/β-catenin信號通路可誘導癌細胞上皮間充質轉化的發(fā)生，并在轉移過程中介導癌細胞的侵襲和遷移[27,28]。此外，有報道表明，CCAT1可提高胰腺癌細胞中Cyclin-D1的表達[15]。細胞周期素Cyclin-D1誘導細胞由G1期過渡至S期，是Wnt/β-catenin的靶基因之一，它的過度表達可引起細胞癌變[29]。本文研究發(fā)現(xiàn)，sh-CCAT1可顯著降低SCC-9細胞中β-catenin、TCF4和Cyclin-D1的表達。β-catenin是Wnt通路的調節(jié)中心，可與TCF形成復合體，從而調控靶基因的表達。TCF4是TCF的一種，可與β-catenin相互結合，參與Wnt/β-catenin信號傳導途徑[30]。實驗結果說明，沉默CCAT1可抑制Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、TCF4和Cyclin-D1的表達，從而阻礙Wnt/β-catenin信號通路的激活。提示CCAT1可促進Wnt/β-catenin信號通路的激活。這一機制可能參與誘導OSCC細胞SCC-9上皮間充質轉化的發(fā)生。

綜上所述，CCAT1在癌組織及OSCC各細胞系中高表達，而沉默CCAT1則可顯著抑制SCC-9細胞增殖，促進細胞凋亡。同時，與Control組SCC-9細胞比較，sh-CCAT1組中SCC-9細胞侵襲、遷移能力降低且上皮間充質轉化受到抑制。此外，沉默CCAT1阻礙Wnt/β-catenin信號通路的激活。提示CCAT1可促進SCC-9細胞增殖，抑制細胞凋亡，且其可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導SCC-9細胞上皮間充質轉化，從而提高SCC-9細胞侵襲、遷移能力，本研究進一步豐富對OSCC發(fā)病機理的了解，為靶向治療OSCC提供理論基礎。