金匱腎氣丸聯(lián)合玉屏風(fēng)散補(bǔ)腎益氣對慢阻肺大鼠IL-8、TNF-α、MMP-9、P-P65和IKB-α的影響①

葉 玲 林小妹

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福州 350003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，長期暴露于煙草煙霧導(dǎo)致氧化應(yīng)激，啟動(dòng)炎癥，IL-8、TNF-α等炎癥因子釋放，黏液過量分泌，黏膜纖毛清除受損，肺結(jié)構(gòu)損壞，出現(xiàn)肺氣腫[1]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，參與宿主的炎癥反應(yīng)，尤其在COPD患者體內(nèi)處于高激活狀態(tài)，可誘導(dǎo)大量炎癥介質(zhì)釋放[2]。給予糖皮質(zhì)激素是治療慢性炎癥疾病的主要手段，其抗炎機(jī)制是通過抑制NF-κB信號(hào)通路，調(diào)控基因表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用,因此被作為COPD的首選藥物。然而長期使用糖皮質(zhì)激素會(huì)使COPD人群對藥物敏感性降低，抑制NF-κB的炎癥表達(dá)減弱或消失[3]。因此尋找一種有效且副作用小的糖皮質(zhì)激素替代治療顯得尤其重要。大量臨床研究表明，中藥治療慢阻肺具有一定療效，且副作用少[4]。本實(shí)驗(yàn)通過研究金匱腎氣丸聯(lián)合玉屏風(fēng)散對煙霧所致慢阻肺大鼠的IL-8、TNF-α、MMP-9、P-P65和IKB-α的變化，探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)用中藥 金匱腎氣丸聯(lián)合玉屏風(fēng)散由生地、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、丹皮、桂枝、附子、黃芪、白術(shù)、防風(fēng)等組成。購于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中藥房，藥劑科提供。將中藥飲片置煎煮容器內(nèi)，加冷水浸泡1～2 h，煮沸30 min，過濾。藥渣加水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成每毫升相當(dāng)于原生藥材0.5 g的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置冰箱保存。

1.1.2試劑 黃果樹牌香煙(貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)，煙熏箱(自制)，戊巴比妥鈉、一次性無菌注射器(江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司)，ELISA試劑盒、PBS(南京生興生物)，PVDF膜(Millipore)，ECL發(fā)光液(Thermo)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型，南京化學(xué)試劑廠)，甲醇和HCl(分析純，南京化學(xué)試劑廠)，丙烯酰胺、亞甲丙烯酰胺、Tris-base、過硫酸銨、TEMED、甘氨酸、SDS[阿拉丁試劑(上海)有限公司]。PBS溶液(南京生興生物)，EDTA修復(fù)液(邁新，貨號(hào):MVS-0099)，H2O2(西亞試劑，貨號(hào):7722-84-1)，蘇木染色液(珠海貝索，貨號(hào):BA-4097)，Antibody Diluent with Backgro-und Reducing Components(Dako貨號(hào):S3022)，蛋白封閉液(Dako，貨號(hào):X0909)，EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-mouse(Dako，貨號(hào):K4001)，EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit(Dako貨號(hào):K4003)，DAB+SUBSTRATE BUFFER、 DAB+CHROMOGEN(Dako，貨號(hào):K3468)。

1.1.3儀器 全自動(dòng)組織脫水機(jī)(普瑞斯星醫(yī)療器械有限公司，型號(hào):PQT-A)，組織包埋機(jī)(普瑞斯星醫(yī)療器械有限公司，型號(hào):PBM-A)，病理組織漂烘儀(普瑞斯星醫(yī)療器械有限公司，型號(hào):PHY-Ⅲ)，切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號(hào):RM2235)，微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司，型號(hào):P70D20P-TF)，SDS-PAGE電泳儀(Bio-Rad)，濕法轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)，脫色搖床(TY-80R,金壇市醫(yī)療儀器廠)，Tanon5200化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Tanon)。

1.2方法

1.2.1造模與標(biāo)本采集 雄性、清潔級SD大鼠由南京醫(yī)科大學(xué)SCXK提供，隨機(jī)將大鼠分為正常對照組、COPD組、COPD+補(bǔ)腎益氣組、COPD+地塞米松組，每組10只，將大鼠置于前后各有一個(gè)通氣孔的有機(jī)玻璃箱(70 cm×70 cm×50 cm)內(nèi)，同時(shí)點(diǎn)燃5只香煙，15 min后打開頂蓋，散去煙霧5 min，重復(fù)上述步驟兩次，每次熏10只，每周6 d，共計(jì)90 d。在連續(xù)熏煙8 d后，第9天開始，在熏煙前1 h，補(bǔ)腎益氣金匱腎氣丸聯(lián)合玉屏風(fēng)散或者地塞米松灌胃(灌胃前無麻醉)，補(bǔ)腎益氣組以及地塞米松組，用含2%DMSO的無菌水溶解(10 ml/kg)，對照組用相同體積的DMSO無菌水灌胃。3個(gè)月后大鼠予以4%戊巴比妥鈉溶液(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，取腹主動(dòng)脈血，室溫下2 h內(nèi)離心，3 000 r/min，離心5 min，取血清作血生化檢測。取完血后，打開胸腔，然后結(jié)扎右側(cè)肺門。分離出頸部氣管后，在氣管下段作一小“T”形切口，采用外徑為1.8 mm的靜脈導(dǎo)管作為經(jīng)手術(shù)置管的氣管插管，并將插管沿切口處緩緩插入，直至左主支氣管下端分叉處完畢。用注射器吸取預(yù)熱的生理鹽水(37℃)2.5 ml，通過導(dǎo)管以較小的壓力將鹽水緩慢注入肺內(nèi)，見大鼠左肺逐漸變得膨隆、蒼白，立即緩慢回抽灌洗液，再將所得液體緩緩注回肺內(nèi)，如此反復(fù)抽注10次，最后一次邊回抽邊將插管緩緩?fù)獍渭s3.5 cm至氣管隆突處，然后將回抽液盛入15 ml的塑料離心管(置于冰浴中)。最后將左肺固定在10%福爾馬林溶液中，用于病理檢測；右肺置于液氮迅速冷凍，儲(chǔ)存于-80℃冰箱保存，用于分子檢測。

1.2.2指標(biāo)檢測

1.2.2.1大鼠肺組織形態(tài) 取新鮮肺組織，進(jìn)行脫水、包埋、切片等處理后，分別予維多利亞藍(lán)染色和HE染色，顯微鏡鏡檢，采集圖像。

1.2.2.2WB檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取肺組織約15 mg,放入勻漿器內(nèi)，加入100 μl RIPA裂解液，研磨組織，至裂解液無沉淀，冰上裂解30 min后，移至離心管中，以12 000 r/min離心5 min，取出上清液，-20℃保存，采用蛋白免疫印跡法檢測。

1.2.2.3ELISA檢測IL-8、MMP-9和TNF-α 取血液和肺泡灌洗液，血液在室溫下自然凝固10～20 min，將血液和肺泡灌洗液離心20 min左右(2 000～3 000 r/min)，仔細(xì)收集兩者上清用于ELISA檢測，室溫下放置。根據(jù)試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1病理結(jié)果

2.1.1模型組大鼠支氣管黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死，纖毛倒伏，部分脫落，有大量炎性細(xì)胞浸潤，部分管腔內(nèi)有黏液栓形成及炎性細(xì)胞滲出，平滑肌增厚，氣道狹窄。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡彈性減弱，呈囊狀擴(kuò)張，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大泡。地塞米松和補(bǔ)腎益氣組略有改善。見圖1。

圖1 大鼠肺組織HE染色(×100，×200)Fig.1 HE staining of rat lung tissue(×100，×200)Note: In model group,the epithelial cells of bronchial mucosa degenerated and necrotized,the cilia lodged,some of them fell off,and a large number of inflammatory cells infiltrated. Some of them had mucus embolus formation and inflammatory cell exudation,smooth muscle thickening and airway stenosis. Alveolar structure disorder,alveolar wall thinning or rupture,alveolar elasticity weakened,cystic dilatation,alveolar cavity expansion,part of the fusion into alveoli. Dexamethasone and Bushen Yiqi group improved slightly.

圖2 大鼠的肺組織維多利亞染色(×100，×200)Fig.2 Victorian staining of lung tissue in rats(×100，×200)Note: The pulmonary vessels in the model group were obviously thickened and narrowed,and the pulmonary vessels in the dexamethasone group and the Bushen Yiqi group were improved.

2.1.2模型組肺血管有明顯的血管壁增厚和管腔變窄，地塞米松組和補(bǔ)腎益氣組有所改善。見圖2。

2.1.3COPD模型組纖毛柱狀細(xì)胞腫脹，纖毛(黃色箭頭)減少，脫落，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞變性，板層小體(紅色箭頭)減少，線粒體(藍(lán)色箭頭)腫脹，空泡化，嵴破壞，甚至消失，血管內(nèi)皮細(xì)胞可見空泡樣變性(綠色箭頭)。見圖3。

2.2P-P65及IKB-α表達(dá)變化 模型組IKB-α表達(dá)明顯降低，補(bǔ)腎益氣組和地塞米松組表達(dá)較模型組升高(P<0.05)。模型組P-P65表達(dá)明顯升高，補(bǔ)腎益氣組和地塞米松組較之下降(P<0.05)。見圖4、5。

圖3 大鼠的肺組織電鏡下檢測Fig.3 Electron microscopic detection of lung tissues in ratsNote: In COPD model group,cilia columnar cells were swollen,cilia (yellow arrow) were reduced and shed,type Ⅱ alveolar epithelial cells degenerated,lamellar corpuscles(red arrow) were reduced,mitochondria (blue arrow) were swollen,vacuolated,cristae was destroyed or even disappeared. Vascular endothelial cells showed vacuolar degeneration (green arrow).

圖4 各組大鼠肺組織IKB-α、P-P65的灰度分析Fig.4 Gray level analysis of IKB-α and P-P65 in lung tissues of rats in each groupNote: The expression of IKB-α in the model group was significantly lower than that in the dexamethasone group and the Bushen Yiqi group (P<0.05).The expression of P-P65 in model group was significantly higher than that in Bushen Yiqi group and dexamethasone group (P<0.05).

圖5 各組大鼠的肺組織IKB-α、P-P65蛋白表達(dá)量Fig.5 Protein expression of IKB-α and P-P65 in lung tissue of rats in each groupNote: The expression of IKB-α in the model group was significantly lower than that in the Bushen Yiqi group and dexamethasone group(P<0.05). The expression of P-P65 in model group was significantly higher than that in Bushen Yiqi group and dexamethasone group (P<0.05).

圖6 各組大鼠血清中IL-8、MMP-9、TNF-α水平Fig.6 Serum levels of IL-8,MMP-9 and TNF-α in rats of each groupNote: IL-8,MMP-9 and TNF-α in the model group increased significantly (P<0.05),while the expression of IL-8,MMP-9 and TNF-α in the Bushen Yiqi group and dexamethasone group decreased (P<0.05).

圖7 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-8、MMP-9、TNF-α水平Fig.7 Levels of IL-8,MMP-9 and TNF-α in alveolar lavage fluid of rats in each groupNote: IL-8,MMP-9 and TNF-α in the model group increased significantly (P<0.05),while the expression of IL-8,MMP-9 and TNF-α in the Bushen Yiqi group and dexamethasone group decreased (P<0.05).

2.3IL-8、MMP-9和TNF-α的變化 模型組IL-8、MMP-9和TNF-α明顯升高(P<0.05)，補(bǔ)腎益氣組和地塞米松組大鼠表達(dá)有所下降(P<0.05)。見圖6、7。

3 討論

COPD氣道炎癥主要累及了全部氣道、肺泡壁、肺實(shí)質(zhì)和肺部血管，涉及的細(xì)胞主要有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，激活的炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，包括IL-8、IL-1、IL-6、TNF-α、GM-CSF、MMP-9 等[5-7]。多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)相互作用共同參與炎癥過程，導(dǎo)致氣道壁的受損和肺氣腫的發(fā)生。NF-κB是由P50和DNA結(jié)合蛋白P65構(gòu)成的異源二聚體，與抑制蛋白IKB結(jié)合以無活性形式幾乎存在于所有細(xì)胞的細(xì)胞漿中。香煙煙霧刺激可活化細(xì)胞[8,9]，導(dǎo)致IKB的磷酸化及降解從而激活NF-κB[10-12]，NF-κB與IKB分離同時(shí)移動(dòng)到細(xì)胞核內(nèi)，激活多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄[13,14]，包括多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α、趨化因子、黏附分子、炎癥相關(guān)的酶類等[15,16]。這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物又可進(jìn)一步活化NF-κB，不斷擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。

糖皮質(zhì)激素是拮抗炎癥反應(yīng)的有效藥物[17]，2011版GOLD指南推薦長期吸入糖皮質(zhì)激素用于嚴(yán)重和非常嚴(yán)重的COPD患者，以及經(jīng)常發(fā)生急性加重且長效支氣管擴(kuò)張劑不能良好控制癥狀的患者。然而，在臨床治療中，與吸入糖皮質(zhì)激素對哮喘的高效相比，糖皮質(zhì)激素對COPD的治療作用有限，即使大劑量吸入糖皮質(zhì)激素甚至口服糖皮質(zhì)激素也不能減緩COPD患者呈進(jìn)行性進(jìn)展的氣流阻塞或降低各種炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子或蛋白酶的表達(dá)，僅10%的COPD患者對吸入型糖皮質(zhì)激素有效[18,19]，2017版GOLD指南不推薦長期單一口服糖皮質(zhì)激素治療，不推薦長期單一吸入糖皮質(zhì)激素治療，除非與長效支氣管擴(kuò)張劑聯(lián)合應(yīng)用，認(rèn)為單一吸入糖皮質(zhì)激素治療效果較差。可見部分COPD患者存在糖皮質(zhì)激素抵抗，因此有必要尋找有效地新型抗炎藥治療COPD的慢性炎癥反應(yīng)。

COPD屬于祖國醫(yī)學(xué)的“咳嗽”、“喘證”、“肺脹”等范疇，肺脹之因，內(nèi)有郁結(jié)，先傷肺氣，復(fù)感外邪，肺臟虛弱，氣陰耗傷，肺氣不得發(fā)泄，則成肺脹。《內(nèi)經(jīng)·靈樞》曰“肺脹者，虛滿而喘咳”。肺脹是一個(gè)由肺氣虛-脾陽虛-腎陽虛陰陽兩虛的轉(zhuǎn)變過程，多屬本虛標(biāo)實(shí)之患。本虛以肺脾腎氣虛為主。許多學(xué)者通過遵循古代醫(yī)家的經(jīng)驗(yàn)方藥并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的臨床研究，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益氣方藥能夠治療哮喘、COPD等慢性呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病，其初步機(jī)理是補(bǔ)腎益氣藥作用于下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(Hypothalamus-Pituitary-Adrenal，HPA)和炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中心療效靶位群，其中補(bǔ)腎藥主要作用于HPA軸靶位群，而益氣藥主要作用于炎性反應(yīng)靶位群，并能調(diào)節(jié)HPA軸功能和炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系，且補(bǔ)腎益氣藥有協(xié)同作用。

金匱腎氣丸出自《金匱要略》具有補(bǔ)肺納腎，降氣平喘之功，是補(bǔ)腎之代表方之一。現(xiàn)代藥理研究表明，金匱腎氣丸具有使腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素的作用，它的主要生理基礎(chǔ)是下丘腦-腺垂體-腎上腺軸，通過調(diào)節(jié)血中17-羥、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平，從而達(dá)到抗炎抗過敏的應(yīng)激作用[20]；玉屏風(fēng)散出自《丹溪心法》具有益氣固表之功，是益氣的代表方之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，玉屏風(fēng)散可以顯著降低哮喘大鼠BALF中IL-5、GM-CSF、TNF-α和sIL-2R含量,改善氣道炎癥狀況[21]。衛(wèi)娜等[22]用玉屏風(fēng)散加減干預(yù)COPD模型大鼠，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺組織的病理形態(tài)得到改善,SIgA、SC因子表達(dá)升高,TNF-α、IL-8表達(dá)降低,提示該方可緩解COPD氣道炎癥，與本研究結(jié)果相同。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)用金匱腎氣丸聯(lián)合玉屏風(fēng)散干預(yù)慢阻肺大鼠，改善肺組織病理形態(tài)，IKB-α增多，P65表達(dá)量降低，炎癥介質(zhì)IL-8、MMP-9及TNF-α減少。治療效果與地塞米松組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。臨床上，對于需要長期使用激素治療，或存在糖皮質(zhì)激素抵抗，且中醫(yī)辨證屬于脾腎氣虛患者可考慮使用補(bǔ)腎益氣中藥治療，具體療效有待臨床進(jìn)一步觀察、研究。