淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ?qū)夤芮虚_大鼠T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的影響①

鞠 靜 譚人千 姚金茜 彭玲玲 黃宗軒 潘宇政 韋進(jìn)新

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530021)

氣管切開術(shù)是臨床搶救危急重癥患者采取的必要手段，但是氣管切開后易并發(fā)肺部疾病，結(jié)合中醫(yī)理論及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，應(yīng)重視肺病從腎論治的研究[1,2]。補(bǔ)腎陽(yáng)中藥淫羊藿(Herba epimedii)是小檗科多年生的草本植物,其有效化學(xué)成分主要有黃酮類和木脂素類化合物。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是淫羊藿中主要的活性成分,屬于黃酮類化合物。淫羊藿次苷Ⅱ(Icariside Ⅱ,ICS-Ⅱ)又名寶藿苷Ⅰ,是ICA的主要腸道代謝產(chǎn)物之一。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿水提取物對(duì)氣管切開大鼠具有提高免疫的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)將從T細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子IL-6及大鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)角度，繼續(xù)探討溫腎陽(yáng)治肺病的分子機(jī)制，旨在找到淫羊藿發(fā)揮作用的有效單體成分，為臨床治療氣管切開后引起的肺部疾病提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 ICA、ICS-Ⅱ(上海源葉生物科技有限公司，HPLC 98%),sIgA、大鼠IL-6酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司),熒光標(biāo)記單克隆抗體(美國(guó)BD公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司FACSCalibur型)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SD大鼠，體重(250±20)g，雄性，SPF級(jí)[廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(桂)2014-0002]。隨機(jī)分成正常對(duì)照組(A)、模型對(duì)照組(B)及模型治療組(C、D)，每組18只。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(20±2)℃，濕度60%，自由進(jìn)水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.2模型制備與給藥 參照文獻(xiàn)[4]制備B、C、D組大鼠氣管切開插管模型。動(dòng)物模型制作成功后6 h進(jìn)行給藥干預(yù)。C組給予ICS-Ⅱ4 mg/(kg·d)、D組給予ICA 30 mg/(kg·d)灌胃，A、B 組給予等量0.9%生理鹽水，每日1 次。

1.2.3取材 給藥后第24、72、168小時(shí)，各組分別取材6只大鼠。用10%(0.35 ml/100 g)水合氯醛腹腔麻醉后，剖開腹腔，經(jīng)腹主動(dòng)脈分別采血2 ml置于肝素抗凝管中(用于測(cè)定T細(xì)胞亞群)、3～4 ml置于普通非抗凝管中(用于測(cè)定血清IL-6含量)。 采集完外周血后立即剖開胸腔,用止血鉗夾閉右主支氣管，用4℃預(yù)冷滅菌0.9%生理鹽水3 ml反復(fù)灌洗肺部3次，共回收肺泡灌洗液約6 ml(用于測(cè)定sIgA、IL-6含量)。

1.2.4外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè) 嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書加樣后，上機(jī)檢測(cè)。用專業(yè)流式數(shù)據(jù)分析軟件 FlowJo 計(jì)算CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+數(shù)值。

1.2.5肺泡灌洗液IL-6、sIgA及血清IL-6檢測(cè) 均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。 用專業(yè)軟件CurveExpert 13.0計(jì)算每個(gè)樣本的濃度。

2 結(jié)果

2.1大鼠外周血CD4+T細(xì)胞亞群 結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。 B組大鼠氣管切開插管后外周血CD4+T細(xì)胞亞群數(shù)量無(wú)明顯變化。C、D兩組與B組相比,C組在168 h明顯高于B組(P=0.043)，D組在72 h、168 h明顯高于B組(P=0.016、0.001)。D組在168 h明顯高于C組(P=0.006),C、D兩組組內(nèi)各時(shí)段相比，C組無(wú)明顯變化，D隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。這些結(jié)果提示，ICS-Ⅱ和ICA均可提高外周血CD4+T細(xì)胞亞群數(shù)量，且ICA效果優(yōu)于ICS-Ⅱ，以168 h最顯著。

2.2大鼠外周血CD8+T細(xì)胞亞群 結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。 B組氣管切開插管大鼠CD8+T細(xì)胞亞群數(shù)量開始明顯降低，168 h與A組相比無(wú)明顯差異。C、D兩組與B組相比，C組在72 h、168 h明顯低于B組(P=0.034、0.006)；D組與B組無(wú)明顯變化。D組在72 h明顯高于C組(P=0.030)。C、D兩組組內(nèi)各時(shí)段相比，C組以72 h降低最明顯(P=0.001)，D組各時(shí)段無(wú)明顯差異。這些結(jié)果提示，ICA和ICS-Ⅱ均可降低外周血T細(xì)胞亞群CD8+含量。

2.3大鼠外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群 結(jié)果見(jiàn)圖1、表3。B組氣管切開大鼠外周血T細(xì)胞亞群CD4+/CD8+在24 h、168 h與A組相比無(wú)明顯差異。C組在24 h明顯高于A組(P=0.018)，在168 h CD4+/CD8+值雖有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且與B組相比差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組在168 h明顯高于A、B、C 3組(P=0.000、0.000、0.001)。C組組內(nèi)各時(shí)段無(wú)明顯差異；D組168 h明顯高于24 h、72 h(P=0.001、0.005)。這些結(jié)果提示，ICA和ICS-Ⅱ均可提高氣管切開大鼠外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群的比值，且ICA效果優(yōu)于ICS-Ⅱ。

2.4大鼠外周血IL-6含量 結(jié)果見(jiàn)表4。B組氣管切開插管后大鼠外周血IL-6含量在72 h明顯降低(P=0.003)。C、D兩組IL-6含量在3個(gè)時(shí)段均明顯低于A、B組(P<0.05)。D組在168 h明顯低于C組(P=0.031)。C、D兩組組內(nèi)各時(shí)段IL-6含量無(wú)明顯變化。這些結(jié)果提示，ICS-Ⅱ和ICA均可抑制氣管切開插管后大鼠外周血IL-6表達(dá)，且ICA效果優(yōu)于ICS-Ⅱ,以168 h最顯著。

2.5大鼠肺泡灌洗液IL-6含量 結(jié)果見(jiàn)表5。 B組氣管切開插管后肺泡灌洗液IL-6含量在3個(gè)時(shí)段均明顯高于A組(P=0.003、0.000、0.003)。 C、D兩組與B組相比， 在72 h、 168 h時(shí)段明顯低于B組，且呈逐漸降低趨勢(shì)(P<0.05)，D組與C組相比無(wú)明顯差異。這些結(jié)果提示，ICS-Ⅱ和ICA均可抑制氣管切開插管后大鼠肺泡灌洗液IL-6表達(dá)，且二者作用效果無(wú)明顯差異。

圖1 各組外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群Fig.1 Peripheral blood CD4+，CD8+T cells in each group

Groupsn24 h72 h168 hFPA624.547±4.11123.691±4.35624.282±4.3940.0350.966B623.396±3.91420.370±0.25022.388±2.2171.2740.321C621.021±4.57923.991±10.73228.930±3.2931.6000.249D618.076±0.311 26.320±2.64737.552±5.12034.1320.000F2.5230.65211.374P0.1000.5980.001

Groupsn24 h72 h168 hFPA613.511±2.03413.259±2.67313.786±1.9370.0350.966B69.501±2.2597.873±0.12414.700±2.9028.4280.011C68.283±1.5114.993±0.0969.095±0.53119.1830.000D69.280±1.2378.416±2.56211.559±1.0213.0340.105F8.15012.8897.230P0.0020.0010.009

2.6大鼠肺泡灌洗液sIgA含量 結(jié)果見(jiàn)表6。 B組氣管切開插管后大鼠肺泡灌洗液sIgA含量24 h即明顯升高(P=0.006)，但在72 h后又降至正常組水平；C、D兩組在72 h、168 h明顯高于B組(P<0.05)；D組在24 h、168 h兩個(gè)時(shí)段明顯高于C組(P<0.05)。這些結(jié)果提示，ICS-Ⅱ和ICA均可提高氣管切開插管后大鼠肺泡灌洗液sIgA含量，且ICA效果優(yōu)于ICS-Ⅱ，以24 h、168 h最顯著。

Groupsn24 h72 h168 hFPA61.843±0.3671.825±0.2101.855±0.3860.0060.994B62.056±0.4722.512±0.1202.161±0.4201.2520.321C62.480±0.2032.652±0.5612.226±0.2831.5220.265D62.042±0.3122.330±0.4183.256±0.30713.2080.002F2.9802.77910.886P0.0630.1020.001

Groupsn24 h72 h168 hFPA639.299±3.26239.100±1.23939.409±2.3200.0110.989B639.876±2.25231.924±1.93935.682±1.62412.4180.007C626.477±2.30027.382±1.78129.714±2.8502.3330.143D629.293±5.76227.589±2.88925.462±2.1621.1950.336F14.29618.81724.331P0.0000.0000.000

Groupsn24 h72 h168 hFPA60.490±0.1240.478±0.1300.489±0.1010.0090.991B61.455±0.3231.159±0.2250.748±0.0779.1930.011C61.556±0.4170.859±0.0270.537±0.03413.8820.006D61.213±0.3110.930±0.1460.519±0.0099.2680.015F7.30124.4067.435P0.0090.0000.011

Groupsn24 h72 h168 hFPA63.886±1.6443.278±1.2383.641±1.0850.1540.861B68.328±2.2114.185±1.7843.243±1.1299.8980.005C69.561±1.56929.168±5.20811.232±5.26226.4860.000D618.240±6.63427.903±2.80618.530±1.6954.3600.059F10.32158.71421.180P0.0010.0000.000

3 討論

《類證治裁》記載:“肺為氣之主,腎為氣之根,肺主出氣,腎主納氣,陰陽(yáng)相交,呼吸乃和?！闭f(shuō)明腎臟在肺部疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有著極其重要的影響。腎氣不足,攝納無(wú)權(quán),肺之清氣不能肅降以下通于腎,氣之升降出入不利,肺腎兩虛,從而導(dǎo)致肺系疾病的急性發(fā)作或病情進(jìn)展。因此腎臟在肺部疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有著極其重要的影響。氣管切開插管易并發(fā)肺部疾病，既往我們研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎陽(yáng)中藥淫羊藿水提取物可改善氣管切開大鼠免疫功能[3]。而中藥淫羊藿發(fā)揮作用的主要活性成分是以ICA為代表的黃酮苷類化合物及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物[5]。ICS-Ⅱ?yàn)镮CA經(jīng)腸道菌群代謝后產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物之一。故本實(shí)驗(yàn)基于ICA和ICS-Ⅱ探討淫羊藿對(duì)氣管切開大鼠發(fā)揮主要作用的有效成分。

細(xì)菌或病毒侵入機(jī)體后，可以引起體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在清除細(xì)菌或病毒等外源微生物中具有重要意義。T細(xì)胞根據(jù)其表達(dá)分子的不同可以分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞主要為輔助性T細(xì)胞(Th),又可分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，其中Th2細(xì)胞可分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，主要為輔助體液免疫應(yīng)答；而CD8+T細(xì)胞主要為抑制性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞,正常情況下,CD4與CD8細(xì)胞保持一定的比例,維持機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。所以外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的百分率以及CD4+/CD8+可作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)[6,7]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ICA和ICS-Ⅱ干預(yù)后，可明顯提高各組CD4+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+，ICS-Ⅱ可降低CD8+T細(xì)胞數(shù)量而ICA對(duì)其無(wú)明顯影響。表明ICA和ICS-Ⅱ可通過(guò)平衡各細(xì)胞亞群比例，提高CD4+/CD8+值，從而提高機(jī)體的免疫水平。且ICA效果優(yōu)于ICS-Ⅱ，尤以168 h最顯著。

細(xì)胞免疫除了與T細(xì)胞亞群及其比例有關(guān),細(xì)胞因子的變化也在其中發(fā)揮重要作用[8]。而細(xì)胞因子則有調(diào)控T細(xì)胞分化的功能[9]。IL-6是一種由T細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子。Sean等[10]用伯氏疏螺旋體感染C3H小鼠,然后注射IL-6，發(fā)現(xiàn)IL-6可抑制Th1細(xì)胞的分化。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，用ICA和ICS-Ⅱ干預(yù)后，C、D兩組外周血及肺泡灌洗液IL-6含量均明顯降低(P<0.05)。根據(jù)Sean等[10]研究提示，ICA和ICS-Ⅱ提高氣管切開大鼠外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量與CD4+/CD8+值的機(jī)制，可能與抑制外周血及肺泡灌洗液IL-6表達(dá)有關(guān)，從而起到抑制炎癥和增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用。

sIgA存在于體液免疫中,是呼吸道黏膜的主要保護(hù)性抗體,是黏膜免疫的第一道防線,可以阻止細(xì)菌和病毒吸附于上皮細(xì)胞表面不形成集落,發(fā)揮清除細(xì)菌、中和病毒和抑制病毒復(fù)制的作用[11]。Diebel等[12]向單核細(xì)胞中加入大腸桿菌和sIgA 并共同培養(yǎng)1 h,再與多形核中性粒細(xì)胞共培養(yǎng),最后測(cè)定促炎因子IL-6、TGF-β和IL-8的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法與不加入sIgA 的培養(yǎng)方法相比,促炎因子 IL-6、TGF-β和IL-8的含量明顯降低。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，用ICA和ICS-Ⅱ干預(yù)后，肺泡灌洗液sIgA含量明顯升高(P<0.05)，且ICA干預(yù)組在24 h、168 h兩個(gè)時(shí)段明顯高于ICS-Ⅱ干預(yù)組。結(jié)合Sean及Diebel等[10，12]研究結(jié)果可以推斷，ICA和ICS-Ⅱ可以通過(guò)促進(jìn)肺泡灌洗液sIgA表達(dá)，抑制外周血及肺泡灌洗液IL-6表達(dá)，并改善T細(xì)胞亞群失衡，從而提高肺部免疫水平，同時(shí)減輕炎性反應(yīng)，且ICA效果優(yōu)于ICS-Ⅱ。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ICA對(duì)氣管切開大鼠提高免疫和減輕炎癥的效果優(yōu)于ICS-Ⅱ，其機(jī)制可能與藥物本身活性有關(guān)，Cheng等[13]研究發(fā)現(xiàn)ICA和ICS-Ⅱ具有不同藥代動(dòng)力學(xué)特性，具體藥理活性作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。