鹽堿脅迫對堿地膚的生物量及含氮化合物的影響

田浩然，楊 傲，劉航鑠，何劉貴杰，趙 航，麻 瑩

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

我國東北草原鹽堿化已經(jīng)超過70%[1]。通常鹽堿化土壤既含有中性鹽又含有堿性鹽，中性鹽脅迫和堿性鹽脅迫實際是兩種不同性質(zhì)的脅迫[2]，分別稱為鹽脅迫和堿脅迫。鹽脅迫和堿脅迫的作用原理及植物對其所作出的生理響應(yīng)是不同的。然而，從研究現(xiàn)狀來看，仍以鹽脅迫為主，目前只有少數(shù)報道涉及到了堿脅迫[3-5]。

氮素是植物體內(nèi)最重要的營養(yǎng)元素，氮代謝則是其體內(nèi)最重要的物質(zhì)代謝。通過影響氮素的吸收、同化、無機氮到有機氮的轉(zhuǎn)化，以及蛋白質(zhì)、核酸等含氮生物分子的合成等生理過程，氮代謝與植物的生長、光合等基本生命活動密切相關(guān)[6]。在研究植物抗逆生理機制時，氮代謝的研究也是不可忽視的。例如，在鎘[7]、砷[8]等重金屬脅迫以及高溫[9]、干旱[10]、鹽[11]等非生物脅迫下，均發(fā)現(xiàn)植物含氮化合物及其相關(guān)酶活性發(fā)生了顯著變化。

堿地膚(Kochia sieversianus)是一種高度抗堿的鹽生牧草(可以在pH ＞ 10的土壤中生存)，其植株黃綠色或稍帶紅色，上端密被白色絨毛。堿地膚還具有一定的藥用價值，其全草及種子均可以作為中藥材使用[1]。由于其既具有極強的耐鹽堿能力又具有很好經(jīng)濟價值，而成為中國東北地區(qū)治理堿化草地的首選牧草之一。以堿地膚為材料研究植物抗鹽堿生理機制、比較抗鹽、抗堿機制的異同，無疑是一種理想的選擇。而有關(guān)鹽或堿脅迫對堿地膚含氮化合物的影響差異目前尚不了解。為此，將堿性鹽(Na2CO3和NaHCO3)和中性鹽(NaCl和Na2SO4)分別以等摩爾比混合，模擬出堿脅迫和鹽脅迫條件以脅迫處理堿地膚幼苗，通過監(jiān)測其生物量及各種含氮化合物含量隨脅迫時間的動態(tài)變化，來比較鹽、堿脅迫對堿地膚氮素積累影響的差異，以期為研究堿地膚的耐鹽堿機制提供必要的理論依據(jù)，同時也為進一步探討高抗鹽堿植物堿地膚特殊的氮代謝調(diào)節(jié)機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 幼苗培養(yǎng)

從吉林省西部天然草原采集堿地膚種子，用砂培法培養(yǎng)[4]。出苗后每天17:00用1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌。每盆16株幼苗(花盆內(nèi)直徑20 cm)。幼苗培養(yǎng)、處理均在室外進行，處理時期人工避雨。

1.2 試驗設(shè)計

將Na2SO4和NaCl兩種中性鹽以1∶1摩爾比混合作為鹽脅迫組(A)，將堿性鹽Na2CO3和NaHCO3以同樣比例混合作為堿脅迫組(B)。鹽脅迫組和堿脅迫組的總鹽濃度都是200 mmol·L-1。這樣可保證鹽脅迫組和堿脅迫組處理液的Na+、總離子濃度相同，而只有兩組的pH不同[4]。以Hoagland營養(yǎng)液作為對照組(CK)。鹽脅迫組(A)、堿脅迫組(B)和對照組(CK)處理液的pH分別為6.58、9.96及6.56[4]。苗齡6周后，將66盆堿地膚(選取長勢一致的幼苗)隨機分成22組，每組3盆即3次重復(fù)[4]。其中1組在處理開始時即取樣測定起始生物量及各種含氮化合物含量，另外7組為對照組(CK)，對照組只澆Hoagland營養(yǎng)液在7個時間點(16，24，36，48，72，96，144 h)，此外，鹽脅迫處理和堿脅迫處理各7組(鹽、堿脅迫處理時間點與對照組相同)。含有相應(yīng)濃度脅迫鹽的營養(yǎng)液為處理液，每盆500 mL處理液透灌[4]。

1.3 取樣及指標(biāo)測定

取樣：按照對應(yīng)的處理時間，依次取出全部植株[4]。分別用自來水和蒸餾水清洗植株，之后吸干植株表面水分。將植株分成莖葉和根兩部分(以子葉痕處為界)，記錄各組莖葉部分的鮮重(fresh weight，F(xiàn)W)。另外從以上樣品中稱取10 g莖葉部分凍干，記錄其干重。將凍干樣品粉碎混勻，用于硝態(tài)氮(NO3--N)、氨態(tài)氮(NH4+-N)、脯氨酸、甜菜堿等含量測定；其余鮮樣殺青(105 ℃，15 min)后置于真空干燥箱內(nèi)(40 ℃)干燥至恒重，計算總干重(dry weight，DW)。指標(biāo)測定：生物量 = 地上干重(DW)/株。含水量 = (FW-DW)/FW × 100%。硝態(tài)氮(NO3--N)用離子色譜法測定[1](美國戴安DX-300離子色譜系統(tǒng)，AS4A-SC離子交換柱，流動相為Na2CO3/NaHCO3=1.7/1.8 mmol·L-1， CDM-II電 導(dǎo) 檢 測 器 )。 氨 態(tài) 氮(NH4+-N)采用改良的茚三酮測定法[12]。脯氨酸和甜菜堿分別用酸性茚三酮法[12]和紫外分光光度法[12]進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析；數(shù)據(jù)采用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，檢驗水平為0.05；Excel 2010制圖。

2 結(jié)果

2.1 鹽、堿脅迫對堿地膚幼苗生物量的影響

非脅迫(對照組)和鹽脅迫條件下，堿地膚地上干重隨著時間的延長呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(P＜ 0.01)，而且對照組生物量的增加幅度(F= 25.43)高于鹽脅迫(F= 5.62)。堿脅迫條件下，其生物量增加并不明顯(P＞ 0.05) (圖1)?？梢姡}或堿脅迫條件，特別是堿脅迫不利于堿地膚生物量的積累。

鹽或堿脅迫條件下，堿地膚地上含水量均呈現(xiàn)降低趨勢(P＜ 0.01)。而堿脅迫的(F= 191.80)下降幅度顯著高于鹽脅迫(F= 29.57)，但是在長時間(144 h)的高堿脅迫(pH ≈ 10)下堿地膚保持著較高的含水量 (≈ 75%) (圖 1)。

2.2 鹽堿脅迫下無機氮的動態(tài)積累特點

在非脅迫條件下(對照組)，NO3--N、NH4+-N含量并未隨時間變化而變化(P＞ 0.05)。NO3--N含量在鹽、堿脅迫16 h時出現(xiàn)峰值，之后其含量均急劇下降，36 h后鹽脅迫下含量保持不變(P＞ 0.05)，而堿脅迫下含量有所升高(圖2)。在鹽、堿脅迫條件下NH4+-N含量先升高而后降低，而且堿脅迫處理下NH4+-N的積累始終高于鹽脅迫(圖2)。此外，鹽、堿脅迫促NH4+-N積累的最高峰出現(xiàn)的時間點也不同。鹽脅迫處理NH4+-N最大積累量出現(xiàn)在48 h，而堿脅迫的時間在72 h。

圖1 鹽堿脅迫下生物量及其含水量的動態(tài)變化Figure 1 Time-course of changes in biomass and water content under salt and alkali stress

圖2 鹽堿脅迫下無機氮含量的動態(tài)變化Figure 2 Time-course of changes in inorganic nitrogen contents under salt and alkali stress

2.3 鹽堿脅迫下有機氮的動態(tài)積累特點

在鹽、堿脅迫下，甜菜堿和脯氨酸均隨著脅迫處理時間的延長而有所積累，其中堿脅迫的作用大于鹽脅迫(圖3)。脯氨酸的變化趨勢是在堿脅迫處理48 h內(nèi)增加緩慢，一旦超過48 h，脯氨酸含量顯著增加(P＜ 0.01)，且其含量的最高峰出現(xiàn)在96 h；鹽脅迫下脯氨酸含量隨時間延長而增加，而且在鹽處理72 h時脯氨酸達到積累最大量，之后有所降低。甜菜堿含量的轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)在鹽堿脅迫24 h處，之后其含量均有所升高，而且在堿脅迫下其含量高于鹽脅迫。

3 討論

3.1 鹽、堿脅迫對堿地膚生物量的影響

生長受到抑制是植物對鹽堿脅迫普遍而直接的反應(yīng)[13]，生長抑制的直接表現(xiàn)就是生物量降低。與對照組(非脅迫條件)相比，鹽、堿脅迫均抑制堿地膚生物量的積累，其中堿脅迫對其抑制作用更強。堿地膚為適應(yīng)堿脅迫(高pH)需要耗費更多的能量和物質(zhì)，因此堿脅迫對堿地膚生物量的抑制更為嚴重。這是在逆境下堿地膚重要的生存策略之一。

降低體內(nèi)含水量是植物響應(yīng)滲透脅迫進行滲透調(diào)節(jié)的一種既迅速又經(jīng)濟的方式[1]。在本研究中，隨著鹽、堿脅迫處理時間的延長，堿地膚莖葉的含水量隨之下降，而堿脅迫的(F= 191.80)下降幅度顯著高于鹽脅迫(F= 29.57)。此外，與抗鹽堿能力強的禾本科植物蘆葦(Phragmites australis)[14]、狗牙根(Cynodon dactylon)[15]以及藥用鹽生植物寧夏枸杞(Lycium barbarum)[15]不同，堿地膚在長時間(144 h)的堿脅迫條件下仍能保持較高的含水量(75%)，高含水量可以最大限度地濃縮細胞質(zhì)中溶質(zhì)濃度，稀釋液泡中有害離子的濃度[14.16]。而堿地膚并不是肉質(zhì)化植物，它在長時間的離子毒害和高pH條件下還保持著較高的含水量，這也許就是決定堿地膚植物既抗鹽又抗堿的關(guān)鍵生理特性之一，這一結(jié)果值得深入研究。

3.2 鹽、堿脅迫對堿地膚含氮化合物的影響

生物量的變化是抗鹽堿植物堿地膚適應(yīng)鹽堿環(huán)境的外在表現(xiàn)，而堿地膚體內(nèi)含氮化合物的變化才是響應(yīng)鹽堿脅迫的內(nèi)在機制。氮是植物生長發(fā)育不可或缺的營養(yǎng)元素。植物中氮主要以有機氮和無機氮兩種形式存在。無機氮的形式主要以硝態(tài)氮(NO3--N)和氨態(tài)氮(NH4+-N)存在，二者也是植物吸收氮素的主要形式[17]。研究表明，當(dāng)植物遭受鹽或堿脅迫等逆境條件時，NO3-在維持滲透平衡和離子穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[18]。NO3--N在鹽、堿處理144 h內(nèi)先后出現(xiàn)“升高-下降-平緩”的趨勢，但堿脅迫下其含量始終高于鹽脅迫，此結(jié)果與甜土植物向日葵(Helianthus annuus)、大麥(Hordeum vulgare)不同，鹽、堿脅迫均抑制向日葵、大麥莖葉NO3--N積累，且堿脅迫抑制作用更大[19-20]?？梢姡鳛榭果}堿植物堿地膚，其特殊的NO3--N吸收機制還有待我們繼續(xù)研究。

圖3 鹽堿脅迫下有機氮含量的動態(tài)變化Figure 3 Time-course of changes in organic nitrogen contents under salt and alkali stress

植物體內(nèi)NO3-可被逐步還原為氨態(tài)氮(NH4+-N)，之后與其自身吸收的NH4+-N一起經(jīng)過一系列生理生化反應(yīng)最終轉(zhuǎn)化為有機氮形式，被植物體利用[21]。用GEOCHEM軟件分析鹽、堿脅迫處理液中離子活度和自由度表明，與鹽脅迫相比，堿脅迫處理液中大部分NH4+-N轉(zhuǎn)化為NH3[22]。在堿脅迫處理液中NH4+-N大量減少的情況下，本研究中雖然鹽、堿脅迫下NH4+-N的含量均呈現(xiàn)先升高而后下降的趨勢，但堿脅迫下NH4+-N的含量始終高于鹽脅迫(圖2)。這可能與堿脅迫下體內(nèi)大量NO--3N還原為NH4+-N及氮素的分配等方面有關(guān)，具體原因需要進一步研究。此外，鹽脅迫(48 h)、堿脅迫(72 h)促進NH4+-N積累的最高峰出現(xiàn)的時間點也不同。綜上，鹽、堿脅迫對堿地膚NH4+-N的積累存在差異。

鹽生植物在遭受非生物脅迫時，通常會合成一些以含氮化合物為主的相容性物質(zhì)，如季胺類化合物，脯氨酸和甜菜堿等[21]。鹽脅迫下植物脯氨酸的大量積累常作為衡量植物耐鹽性的標(biāo)志[23]。而本研究結(jié)果表明，脯氨酸在堿脅迫48 h后才積累，并且其含量極低(其含量占總有機溶質(zhì)的0.3%～1.1%)?？梢?，脯氨酸完全失去了一個敏感脅變指標(biāo)的特點。它的積累可能不是響應(yīng)滲透脅迫的結(jié)果，而可能是一種抗鹽堿的適應(yīng)性防御反應(yīng)。此外，在植物細胞生理干旱條件下，脯氨酸的增加還有利于保持細胞或組織的持水能力，提高植物在鹽漬脅迫的適應(yīng)性。

研究表明，甜菜堿主要在葉綠體中合成，甜菜堿在植物體內(nèi)合成后幾乎不被分解[24]，本研究中，對照組(CK)的甜菜堿含量(占干重 2.4%)很高，堿地膚體內(nèi)甜菜堿含量高可能與其抗鹽堿逆境的調(diào)節(jié)機制有關(guān)。隨著鹽堿脅迫時間的延長，甜菜堿含量持續(xù)增加(最高可占干重3.5%)，而且在堿脅迫下其含量高于鹽脅迫。

4 結(jié)論

與鹽脅迫相比，堿脅迫嚴重抑制堿地膚的生長(生物量、含水量降低)，更促進含氮化合物(脯氨酸、甜菜堿)的積累?？梢?，堿脅迫對堿地膚氮代謝的影響更為嚴重，堿地膚響應(yīng)堿脅迫的氮代謝調(diào)節(jié)機制是非常復(fù)雜的，值得深入探討。也再次印證了鹽、堿脅迫是兩種不同性質(zhì)的脅迫，堿脅迫對植物的影響更復(fù)雜、更嚴重[2]。