褪黑素通過抑制JAK2/STAT3通路抑制IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

謝婷婷 李雯惠 蘇瑛 韓碧潔 于月成

卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤[1]。雖然近年來卵巢癌的手術(shù)治療和放化療手段有了很大的進(jìn)步，但是由于該疾病的早期病變不明顯，且病情進(jìn)展迅速，多數(shù)患者在確診時已經(jīng)處于晚期，這導(dǎo)致了該疾病的5年生存率低于30%，且預(yù)后較差[2-3]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移可促進(jìn)卵巢癌的疾病進(jìn)展，降低患者的生存率[3]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一個重要分子機(jī)制[4]。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6是癌相關(guān)成纖維細(xì)胞和癌細(xì)胞產(chǎn)生的一個促炎因子，其在卵巢癌患者的血清和腹水中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)不僅與患者的不良預(yù)后相關(guān)，也與卵巢癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移特征有關(guān)[5]。IL-6可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT[6]。褪黑素主要是由松果體分泌的吲哚類物質(zhì)。Zhao等[7]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在卵巢癌患者血清中的水平低于正常女性。褪黑素不僅能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的活力[8]，還可以抑制卵巢癌干細(xì)胞的遷移和侵襲、減少其EMT進(jìn)程[9]。但是褪黑素對IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞EMT還沒有相關(guān)研究。因此，本研究用重組IL-6蛋白和褪黑素共同處理卵巢癌SKOV3細(xì)胞，探究褪黑素對IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和EMT的作用和機(jī)制。

材料與方法

一、材料

卵巢癌SKOV3細(xì)胞購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基購買于美國Invitrogen公司，胎牛血清、胰酶和青霉素-鏈霉素購買于美國Gibco公司，重組IL-6蛋白和褪黑素購買于美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購買于上海碧云天公司，結(jié)晶紫染色液購買于北京索萊寶公司，RNAisoPlus試劑購買于大連寶生物，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、Real-time PCR試劑盒TransStart Tip Green qPCR SuperMix和Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)購買于北京全式金生物公司，RIPA裂解液購買于上海捷瑞公司，E-cadherin和Vimentin抗體購買于美國Abcam公司，Janus激酶2(JAK2)、磷酸化JAK2(p-JAK2)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體購買于美國Cell signaling technology公司。

二、實驗方法

1. CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力：使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，待細(xì)胞生長至對數(shù)期后，胰酶消化傳代，接種到96孔板中，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。加入不同濃度褪黑素(1、2、4、6、8 mM)和50 ng/mL IL-6繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)測定的細(xì)胞活力，選擇兩個濃度，進(jìn)行后續(xù)實驗。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：將胰酶消化后過夜培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞隨機(jī)分成四組：對照組、IL-6組、IL-6+褪黑素低劑量組和IL-6+褪黑素高劑量組。其中對照組中不加任何處理，IL-6組中加入50 ng/mL IL-6，IL-6+褪黑素低劑量組中同時加入50 ng/mL IL-6和低濃度的褪黑素，IL-6+褪黑素高劑量組中同時加入50 ng/mL IL-6和高濃度的褪黑素。各組中加入不同試劑處理48 h，進(jìn)行檢測。

3. Transwell檢測細(xì)胞遷移：將SKOV3細(xì)胞按照方法1處理48 h后，使用胰酶消化，然后將含有5×104個細(xì)胞的200 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基加入到Transwell上室，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽將上層未遷移的細(xì)胞輕輕擦去，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色液染色15 min。然后在顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野拍照，計數(shù)每個視野中細(xì)胞數(shù)目的平均值即為每個小室中遷移細(xì)胞的數(shù)目。

4. 總RNA提取和Real-time PCR：將各組細(xì)胞中的培養(yǎng)基棄去，冰冷的PBS緩沖液清洗一次，然后按照RNAisoPlus溶液說明書操作提取細(xì)胞的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000分別檢測所提取總RNA的完整性以及濃度和純度。取1 μg純度較高且完整性好的RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，按照Real-time PCR試劑盒操作行real-time PCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參，按照公式2-△△Ct計算目的基因E-cadherin和Vimentin的相對表達(dá)量。引物序列如下：E-cadherin上游引物5′-GTGCCTGAGAACGAGGCTA -3′，下游引物5′-CTGCATCTTGCCAGGTCCTT-3′； Vimentin上游引物5′-GACGGTTGAAACTAGAGATGG-3′，下游引物5′-GCTGGTAATATATTGCTGCA-3′；GAPDH上游引物5′-TGAAGACGGGCGGAGAGAAA-3′，下游引物5′-CCAATACGACCAAATCCGTTGAC-3′。

5. 總蛋白提取和Western blot檢測：取培養(yǎng)的各組細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 g離心30 min，上清液即為所提取的總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，每孔取40 μg總蛋白，沸水浴將其變性后行SDS-PAGE電泳分離蛋白。利用半干轉(zhuǎn)法將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后加入提前稀釋好的一抗4℃過夜孵育，TBS溶液洗膜三次，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育45 min，TBST洗膜三次，加入ECL發(fā)光液后拍照，使用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

結(jié) 果

一、不同濃度褪黑素對IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力的影響

用不同濃度褪黑素(1、2、4、6、8 mM)與50 ng/mL IL-6處理SKOV3細(xì)胞48 h，CCK-8檢測細(xì)胞活力，結(jié)果見表1。與對照組相比，IL-6處理后細(xì)胞活力增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IL-6單獨(dú)處理相比，除了1 mM褪黑素外，其它幾個濃度的褪黑素均能降低IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞活力，且具有劑量依賴性(P<0.05)?？紤]到高濃度可能會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，后續(xù)實驗中褪黑素濃度使用2 mM和4 mM。

表1 各組細(xì)胞活力的比較(n=3)Table 1 Comparison of cell viability in different groups (n=3)

Note:*Compared to control,P<0.05;#Compared to IL-6,P<0.05

二、褪黑素對IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移的影響

Transwell檢測細(xì)胞遷移，結(jié)果如圖1和表2所示：與對照組相比，IL-6組中遷移細(xì)胞數(shù)目增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+褪黑素組中遷移細(xì)胞數(shù)目減少，且IL-6+褪黑素高劑量組中遷移細(xì)胞數(shù)目更低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組中細(xì)胞遷移情況Figure 1 Cell migration in different groups

GroupMigrated cell numberControl 74.7±6.5IL-6 137.7±10.3?IL-6+ low-melatonin 108.3±7.0#IL-6+ high-melatonin 95.0±8.9#

Note:*Compared to control,P<0.05;#Compared to IL-6,P<0.05

三、褪黑素對IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞EMT的影響

Real-time PCR檢測各組細(xì)胞E-cadherin和Vimentin mRNA的表達(dá)，結(jié)果如表3所示：與對照組相比，IL-6組中E-cadherin mRNA表達(dá)降低、Vimentin mRNA表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+褪黑素組中E-cadherin mRNA表達(dá)增加、Vimentin mRNA表達(dá)降低，且IL-6+褪黑素高劑量組中這些變化更加明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Western blot檢測各組細(xì)胞E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖2和表3所示：與對照組相比，IL-6組中E-cadherin蛋白表達(dá)降低、Vimentin蛋白表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+褪黑素組中E-cadherin蛋白表達(dá)增加、Vimentin蛋白表達(dá)降低，且IL-6+褪黑素高劑量組中這些變化更加明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)情況(n=3)Table 3 The mRNA and protein levels of E-cadherin and Vimentin in different groups (n=3)

Note:*Compared to control,P<0.05;#Compared to IL-6,P<0.05

圖2 各組E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)Figure 2 The protein levels of E-cadherin and Vimentin in different groups

四、褪黑素能夠抑制IL-6誘導(dǎo)的JAK2/STAT3通路

Western blot檢測JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3和表4所示：與對照組相比，IL-6組中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的值均增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+褪黑素組中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的值降低，且IL-6+褪黑素高劑量組中兩比值變化更加明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 各組p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)Figure 3 The protein levels of p-JAK2, JAK2, p-STAT3 and STAT3 in different groups

Groupp-JAK2/JAK2p-STAT3/STAT3Control 0.1±0.00.3±0.1IL-6 1.1±0.1?1.3±0.1?IL-6+low-melatonin 0.7±0.1#0.9±0.1#IL-6+high-melatonin 0.4±0.1#0.7±0.1#

Note:*Compared to control,P<0.05;#Compared to IL-6,P<0.05

討 論

研究顯示炎癥是卵巢癌細(xì)胞種植的一個關(guān)鍵因素[10]。IL-6是一個多效性的炎性細(xì)胞因子。它在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[11]。在卵巢癌患者的血清和腹水中發(fā)現(xiàn)IL-6的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)與患者的不良預(yù)后和卵巢癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移特征相關(guān)[5]。IL-6還可以介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐受，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT[6,12]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6能夠增加SKOV3細(xì)胞的活力、遷移和EMT。

褪黑素具有多種生理功能，包括調(diào)節(jié)生理節(jié)律、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗氧化等[13]。大量文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)褪黑素對多種腫瘤具有明顯的抑制作用[14]。近年來褪黑素在卵巢癌中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。研究顯示褪黑素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的活力，抑制卵巢癌干細(xì)胞的遷移和侵襲、減少其EMT[8-9]。此外，褪黑素與癌細(xì)胞EMT的關(guān)系近年來也有相關(guān)研究。Wang等[15]的研究發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠抑制胃癌細(xì)胞的EMT。外源性和內(nèi)源性褪黑素都可以通過抑制EMT來抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特性[16]。本研究結(jié)果顯示褪黑素能夠抑制IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力、遷移和EMT，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。

STAT3是一個胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，它可以被JAK家族的酶激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子信號。在正常組織中STAT3的活化是被嚴(yán)格控制的，但是在超過70%的實體瘤和血液腫瘤中，磷酸化激活的STAT3是組成型表達(dá)的[17]。JAK2/STAT3通路的活化能夠調(diào)節(jié)多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展，促進(jìn)癌癥的浸潤、轉(zhuǎn)移和EMT[18-19]。在卵巢癌中STAT3持續(xù)活化，抑制JAK/STAT3通路能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的生長[17]。在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，IL-6誘導(dǎo)的EMT與JAK2/STAT3通路的活化密切相關(guān)[19]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)在SKOV3細(xì)胞中IL-6也能夠促進(jìn)JAK2/STAT3通路的活化。Kang等[20]的研究顯示在巨噬細(xì)胞中褪黑素抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)和一氧化氮產(chǎn)物與JAK2/STAT3通路的活化被抑制相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)與IL-6組相比，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的值在IL-6+褪黑素組中降低，且具有劑量依賴性。這表明在SKOV3細(xì)胞中褪黑素可以抑制IL-6誘導(dǎo)的JAK2/STAT3通路的活化?？傊?，本研究結(jié)果表明褪黑素能夠抑制IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞EMT，這可能是通過抑制JAK2/STAT3通路的活化發(fā)揮作用的。本研究結(jié)果為褪黑素用于卵巢癌的治療提供了實驗依據(jù)。